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    潰瘍性結(jié)腸炎患者正常與病變腸段腸道菌群比較

    2011-06-07 05:45:22林漫鵬鄭雪玲
    關(guān)鍵詞:腸段乳酸桿菌粘膜

    劉 偉,劉 翔,林漫鵬,鄭雪玲,楊 濤

    廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(廣東 廣州 510260)

    潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種慢性非特異性的炎癥性腸病,其病因和發(fā)病機制尚不明確。目前多認為是由多種因素共同作用的結(jié)果,主要包括感染、免疫、遺傳、精神及心理等因素,其中感染因素在UC發(fā)病中發(fā)揮重要作用,因此近年來對UC和腸道菌群之間的關(guān)系展開了大量的研究。腸道菌群失調(diào)對于UC的致病機制究竟有何意義尚不完全清楚,故本項目選取病變僅局限于乙狀結(jié)腸以下的潰瘍性結(jié)腸炎患者,分別在乙狀結(jié)腸以上的正常腸段和乙狀結(jié)腸以下的病變腸段用結(jié)腸鏡取得活檢標(biāo)本,用PCR方法檢測標(biāo)本的細菌含量,從而比較正常腸段和異常腸段的菌群差異,以探討腸道菌群失調(diào)在UC致病機制中的可能作用。

    1 資料和方法

    1.1患者入選標(biāo)準(zhǔn)潰瘍性結(jié)腸炎患者40例,均為我院就診的患者,均經(jīng)結(jié)腸鏡和病理學(xué)檢查確診,且病變均局限在乙狀結(jié)腸及以下腸段。其中男性患者21例,女性患者19例,年齡16~83歲,平均年齡52歲,分別在病變腸段(乙狀結(jié)腸以下腸道)及正常腸段(乙狀結(jié)腸以上腸道)取粘膜組織做細菌學(xué)檢查。另選40例正常對照,其中女性20例,男性20例,年齡18~75歲,平均年齡48歲,分別在乙狀結(jié)腸以上腸段及乙狀結(jié)腸以下腸段取粘膜組織做細菌學(xué)檢查。

    1.2材料和儀器DNA提取試劑購自廣州達安基因,10×PCR buffer、dNTPs、Taq酶等購自Tiangen公司。常規(guī)的化學(xué)試劑為分析純。生物安全柜Bioaer公司BSC-1500Ⅱ型,熒光PCR儀Biorad公司MJ Opticon2型。

    細菌引物:上游通用引物BEL863f:CAGGATTAGATACCCTGGTAGTCC;下游特異引物:雙歧桿菌引物B953r:CGTTAGCTCCGACACGGAACCC;乳酸桿菌引物L(fēng)961r:GCTTAATGCGTTAGCTGCRGCACTG;大腸桿菌引物E953r:CGTTAGCTCCGGAAGCCACGCC。探針:雙歧桿菌探針B892:FAM-CCGTAAACGGTGGATGCTGGATGTGGGG-BHQ1;乳酸桿菌探針L892:FAM-CCGTAAACGATGARTGCTARGTGTTGGAGGG-BHQ1;大腸桿菌探針E892:FAM-CCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGC-BHQ1。均由上海英駿生物技術(shù)有限公司ABI 3900臺式高通量DNA合成儀合成。

    1.3試驗方法50 mg組織研磨成勻漿,提取DNA后,100℃ 10 min,12000 r/min,5 min,立即使用熒光PCR。25 μl體系,94℃ 2 min;94℃5 sec,55℃30 sec,read plate(FAM),40 cycles,30℃ 5 sec。反應(yīng)結(jié)束后,MJ Opticon2自動分析并計算結(jié)果。

    2 結(jié)果

    2.1健康人腸道菌群對數(shù)值健康人乙狀結(jié)腸以上腸段雙歧桿菌、乳酸桿菌及大腸桿菌數(shù)量對數(shù)值分別為8.71±0.44、9.01±0.33、7.01±0.13,乙狀結(jié)腸以下腸段雙歧桿菌、乳酸桿菌及大腸桿菌數(shù)量對數(shù)值為9.21±0.24、9.02±0.18、7.12±0.21,乙狀結(jié)腸以上腸段與乙狀結(jié)腸以下腸段細菌數(shù)量無明顯差異(P<0.05)。見表1。

    2.2 UC患者腸道菌群對數(shù)值

    2.2.1 UC患者乙狀結(jié)腸以上腸段與乙狀結(jié)腸以下腸段菌群比較:雙歧桿菌、乳酸桿菌含量均明顯降低(P<0.05),大腸桿菌明顯升高(P<0.05)。見表1。

    2.2.2 UC患者與健康人腸道菌群比較:UC患者正常腸段與健康人乙狀結(jié)腸以上及乙狀結(jié)腸以下腸段比較,雙歧桿菌、乳酸桿菌及大腸桿菌數(shù)量均無明顯差別(P>0.05);UC患者病變腸段與健康人乙狀結(jié)腸以上及乙狀結(jié)腸以下腸段比較,雙歧桿菌、乳酸桿菌含量均明顯降低(P<0.05),大腸桿菌明顯升高(P<0.05)。見表1。

    表1 各組樣本中細菌的對數(shù)值

    3 討論

    每年都有大量的UC患者被新發(fā)現(xiàn)和確診。因為UC的病因及發(fā)病機制迄今未明,故缺乏有效的預(yù)防及藥物徹底治愈的方法,被稱為“不是癌癥的癌癥”,不僅給患者帶來極大的身心傷害,而且極大的耗費著社會的醫(yī)療資源。弄清UC的發(fā)病機制并尋找其有效的治療手段就成為了當(dāng)前重要而迫切的任務(wù)。

    對于UC和腸道菌群之間的關(guān)系,目前多數(shù)學(xué)者認為是腸道菌群的組成、比例等方面的改變導(dǎo)致腸道內(nèi)微生態(tài)環(huán)境的變化,從而引起宿主產(chǎn)生異常免疫反應(yīng)導(dǎo)致UC的發(fā)病[1~5]。本研究發(fā)現(xiàn)正常人腸道不同部位其雙歧桿菌、乳酸桿菌及大腸桿菌數(shù)量大致是相當(dāng)?shù)?,說明正常人結(jié)腸的菌群比較穩(wěn)定而且一致,提示在用益生菌療法時無須考慮結(jié)腸腸道菌群差異的問題,全結(jié)腸均可以選用相應(yīng)的益生菌制劑。本研究同時發(fā)現(xiàn),UC患者的病變腸腔粘膜上,雙歧桿菌、乳酸桿菌的數(shù)量較正常腸腔明顯降低,說明病變腸腔粘膜微生態(tài)已經(jīng)嚴(yán)重破壞,這與國外Poxton[6]等人的研究是一致的。但雙歧桿菌、乳酸桿菌的數(shù)量變化是造成UC疾病的始動因素,還是UC病變破壞腸道粘膜,使得雙歧桿菌、乳酸桿菌繼發(fā)性減少,尚不確定。但本研究亦發(fā)現(xiàn),雙歧桿菌、乳酸桿菌減少的同時大腸桿菌卻反而升高,考慮UC病變破壞腸道粘膜單單引起雙歧桿菌、乳酸桿菌減少的可能性不大,故提示雙歧桿菌、乳酸桿菌的數(shù)量變化參與UC疾病的發(fā)病機制的可能性更大,國外Alexander[7~9]等學(xué)者認為正是由于腸道粘膜菌群失調(diào),并且腸粘膜清除細菌的功能受損,使得糞便中致病菌的侵襲性顯著增加,促進了局部炎癥及免疫紊亂的發(fā)生,最終導(dǎo)致UC,故可在此方面進一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)UC患者的病變腸腔粘膜與正常人腸道粘膜的菌群比較亦存在雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)量降低、大腸桿菌升高的特點,提示在益生菌療法上可先予抗生素殺滅大腸桿菌等致病菌,繼而補充雙歧桿菌、乳酸桿菌的序貫療法,則不但可殺滅致病菌,而且有利于雙歧桿菌、乳酸桿菌等益生菌避開抗生素使用時期,更易于定植,可進一步進行相關(guān)研究。

    [參考文獻]

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