同時(shí)檢測(cè)禽類六種病毒的金標(biāo)銀染可視化基因芯片的構(gòu)建及初步應(yīng)用

向 華，楊國淋，曹三杰，黃小波，伍 銳，趙 勤，文心田，文翼平

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都 611130)

隨著我國家禽養(yǎng)殖業(yè)集約化和規(guī)模程度的提高，家禽呼吸和免疫抑制類疾病的發(fā)病率逐漸上升。禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)、雞傳染性喉氣管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus，ILTV)是引發(fā)家禽呼吸道疾病的重要病毒性病原。傳染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus， IBDV)、雞馬立克病病毒(Marek’s disease virus，MDV)、禽白血病病毒(avian leukosis virus，ALV)是引發(fā)家禽免疫抑制病的主要病毒性病原，臨床癥狀相似，難以鑒別診斷，并表現(xiàn)出從單一的病原感染向多種病原混合感染方向發(fā)展的趨勢(shì)。如J亞群ALV的env基因的可變區(qū)不斷地發(fā)生變化，導(dǎo)致該病毒的抗原性不斷地進(jìn)化和改變[1-2]。2013年，新的AIV亞型H7N9被發(fā)現(xiàn)[3-4]。新出現(xiàn)的毒株，給家禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也嚴(yán)重威脅著人類的健康。

基因芯片是繼PCR后發(fā)展起來的一項(xiàng)具有快速、特異性好、敏感性強(qiáng)及高通量等優(yōu)點(diǎn)的自動(dòng)化基因檢測(cè)技術(shù)，已被廣泛地應(yīng)用于藥物開發(fā)、基因突變、基因表達(dá)等方面[5]。目前基因芯片在禽類病毒檢測(cè)方面的應(yīng)用大多是基于熒光掃描的基因芯片技術(shù)或酶與底物可視化顯色技術(shù)[3, 6-9]。然而熒光掃描比較昂貴，酶和底物顯色所使用的尼龍膜或者纖維素性薄膜芯片不易保存，這極大地限制了芯片診斷在臨床診斷中的應(yīng)用。近年來，關(guān)于金標(biāo)銀染可視化顯色技術(shù)與基因芯片相結(jié)合的文獻(xiàn)報(bào)道呈遞增趨勢(shì)[10-11]，因其檢測(cè)結(jié)果可脫離昂貴的傳統(tǒng)熒光掃描儀，且操作簡(jiǎn)單，高靈敏性等特點(diǎn)，已廣泛地應(yīng)用于基因突變分析、疾病診斷、藥物篩選等方面[12-14]，因此越來越廣泛地被人們用于疾病的檢測(cè)[2]。

考慮到家禽疫病防控急需，且目前尚未見ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV和ILTV六種病毒金標(biāo)銀染可視化基因芯片的報(bào)道。因此，本研究以ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV以及ILTV為研究對(duì)象，通過金標(biāo)銀染顯色，構(gòu)建了一套能夠同時(shí)檢測(cè)這六種禽類病毒的可視化基因芯片檢測(cè)技術(shù)，為家禽呼吸道和免疫抑制病的臨床標(biāo)準(zhǔn)化診斷應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，從而保障我國養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 生物材料

靶基因重組質(zhì)粒T/AIV-np、T/DNV-f、T/ILTV-tk、λ定位基因重組質(zhì)粒，大腸桿菌DH5α由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)豬病研究中心構(gòu)建并保存。MDV和IBDV組織液由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院黃勇教授提供。ALV的DNA核酸由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)崔治中教授提供。臨床病料采自四川安岳、大邑、彭州、蒲江等地區(qū)疑似禽白血病、馬立克病、雞傳染性法氏囊病、禽流感、新城疫和雞傳染性喉氣管炎患病雞的喉氣管、肺、脾、肝、腎及法氏囊組織。

1.2 主要試劑

總RNA提取試劑盒、DNA提取試劑盒、普通DNA膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；PrimeScript RT Reagent Kit購自寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自美國Omega公司；晶芯芯片點(diǎn)樣液、晶芯光學(xué)級(jí)醛基基片、晶芯12樣品芯片圍欄購自北京博奧生物有限公司；金標(biāo)鏈霉親和素Nanogold-Streptavidin購自美國Nanoprobes公司；銀染試劑Silver buffer A、Silver buffer B購自美國Sigma公司；封閉液按照0.5% BH4Na，25% Ethanol，0.75×PBS比例配制。

1.3 主要儀器

晶芯?SmartArrayerTM16，微陣列芯片點(diǎn)樣系統(tǒng)Capitalbio Corporation購自北京博奧生物公司；分子雜交儀購自美國Thermo公司；芯片雜交盒及雜交相關(guān)產(chǎn)品購自北京Capitalbio生物有限公司；高純氮?dú)馄抠徸运拇ü诜鍤怏w有限公司。

1.4 ALV-env、MDV-meq、IBDV-vp2基因的克隆鑒定

λ定位基因的引物參考曹三杰[15]設(shè)計(jì)合成。利用DNAStar軟件的Megalign對(duì)NCBI收錄的ALV、MDV、IBDV毒株的基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，以Primer5.0設(shè)計(jì)3對(duì)引物(ALV的env基因，MDV的meq基因，IBDV的vp2基因)，靶基因擴(kuò)增長(zhǎng)度在200～800 bp之間，Tm為(55±5) ℃，引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成(表1)，用生物素對(duì)靶基因下游引物的5′端進(jìn)行修飾。

提取IBDV毒株的總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，提取ALV、MDV的DNA，以cDNA/DNA為模板擴(kuò)增目的基因，1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，切膠回收產(chǎn)物連接pMD19-T Simple載體，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒后陽性的重組質(zhì)粒送上海生物工程有限公司測(cè)序后保存?zhèn)溆?。取ALV-env、MDV-meq、IBDV-vp2、AIV-np、NDV-f、ILTV-tk和λ菌落分別進(jìn)行菌液PCR，用生物素對(duì)靶基因下游引物的5′端進(jìn)行修飾。

表1病毒靶基因引物

Table1Primersfortargetgenesofvariousvirus

靶基因Target gene長(zhǎng)度/bpLength引物序列(5′→3′)Primer sequencesALV-env312F: GGATGAGGTGACTAAGAAAGR: GGGAGGTGGCTGACTGTGTMDV-meq512F: CAGGGAGCAGACGGACTAR: GAGGGCAGAAGAGGGAATIBDV-vp2743F: GGCCCAGAGTCTACACCATAACR: CCGGATTATGTCTTTGAAGCCAIV-np272F:CCAGAAGCGGAGGAAACAR:GTCAAAGGAAGGCACGATNDV-f440F:CAAGAACCCAGCACCTATGATGR:GTCGGAGGATGTTGGCAGCILTV-tk278F:TCCTCGTAGATAGGCACCCACTCR:TACGTTGGAGGTAGGTGGTAGTATTCAλ500F:AAAGCGACGCAATGAGGCACTR:GTTCCACGACCGCAACTGC

F.上游引物；R.下游引物

F. Forward primer; R. Reverse primer

1.5 探針設(shè)計(jì)與芯片制備

針對(duì)每個(gè)靶基因序列片段，各選取一條單鏈核酸序列作為寡核苷酸探針，確保各探針的Tm值為75 ℃±5 ℃，長(zhǎng)度為45 bp左右，并在每條寡核苷酸探針的5′端添加15個(gè)T堿基作為連接臂，同時(shí)進(jìn)行氨基化修飾。探針由上海生物工程有限公司合成(表2)。

將點(diǎn)樣緩沖液和ddH2O按1∶4的比例混勻，用以稀釋合成的寡核苷酸探針，調(diào)整其終濃度為50 μmol·L-1， 按照設(shè)計(jì)好的檢測(cè)陣列排布進(jìn)行非接觸噴樣方式噴樣(圖1)。噴樣結(jié)束后，紫外交聯(lián)5 min，芯片置于濕盒內(nèi)，37 ℃水合過夜。隨后，在37 ℃條件下，封閉液封閉30 min。取出芯片，超純水清洗5次。自然干燥，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2探針信息

Table2Informationofprobes

靶基因Target gene長(zhǎng)度/bp Length引物序列(5′→3′)Primer sequencesALV-env312P:NH2-T15-GGATTTCTGCCTCTCTACACAGTCAGCCACCTMDV-meq512P:NH2-T15-ATGGAGTTTGTCTACATAGTCCGTCTGCIBDV-vp2743P:NH2-T15-TGAACTAGCAAAGAACCTGGTCACAGAATACGGCAIV-np272P:NH2-T15-CAAGCCAAACAAAATGCTGCCAACATCCTCNDV-f440P:NH2-T15-CCCTCTGTTGGTTGGTGTTTCCTCCGCTTCTILTV-tk278P:NH2-T15-CTGCCTCATGAATACTACCACCTACCTCCAACGλ500P:NH2-T15-GATTTGGAGGGCAGTTGCGGTCGTG

圖1 基因芯片矩陣設(shè)計(jì)圖Fig.1 The design of DNA chip

1.6 可視化基因芯片的檢測(cè)

用生物素標(biāo)記的引物分別擴(kuò)增ALV-env、MDV-meq、IBDV-vp2、NDV-f、AIV-np和ILTV-tk六種靶基因，并將其PCR產(chǎn)物等量混勻，于100 ℃水浴變性5 min，立即冰浴3 min，防止DNA雙鏈復(fù)性。隨后將PCR產(chǎn)物混合液加入含圍欄固定的芯片陣列區(qū)域，40 ℃條件下雜交120 min，雜交結(jié)束后，超純水洗凈后自然干燥。將質(zhì)量濃度為4 μg·mL-1的Nanogold-Streptavidin的鏈霉親和素溶液緩慢加入到芯片對(duì)應(yīng)的陣列區(qū)域，37 ℃孵育30 min。超純水洗凈后自然干燥。避光條件下，將銀染試劑中的Silver buffer A和Silver buffer B等體積混勻，取200 μL混合液加入芯片陣列區(qū)域，觀察并記錄芯片上可視化信號(hào)出現(xiàn)的時(shí)間。當(dāng)可視化芯片陽性對(duì)照相應(yīng)位置出現(xiàn)明顯的雜交信號(hào)，而陰性對(duì)照相應(yīng)位置無明顯的雜交信號(hào)時(shí)，清洗芯片，終止顯色。眼觀可視化芯片結(jié)果，在芯片相應(yīng)位置若出現(xiàn)明顯黑色銀染信號(hào)，即判定為雜交陽性，反之則判定為雜交陰性。

1.7 可視化基因芯片的質(zhì)量評(píng)價(jià)

1.7.1 特異性試驗(yàn) ALV-env、MDV-meq、IBDV-vp2、AIV-np、NDV-f和ILTV-tk的單鏈靶基因，單獨(dú)與芯片進(jìn)行雜交顯色，眼觀雜交結(jié)果。

1.7.2 敏感性試驗(yàn) 使用ddH2O將提取的靶基因質(zhì)粒(初始質(zhì)量濃度為1 ng·μL-1)依次進(jìn)行101～105倍稀釋，PCR擴(kuò)增標(biāo)記，擴(kuò)增產(chǎn)物混勻后與芯片進(jìn)行雜交顯色，眼觀雜交結(jié)果。

1.7.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將同一批生產(chǎn)的芯片，分別放置在常溫和4 ℃條件下密封保存。分別在30、60、75、90 d隨機(jī)抽出一張芯片，按照“1.6”步驟，與生物素標(biāo)記的靶基因進(jìn)行雜交，銀染顯色眼觀結(jié)果，以評(píng)價(jià)芯片的穩(wěn)定性。

以上特異性、敏感性及穩(wěn)定性試驗(yàn)均重復(fù)三次。

1.8 臨床樣品的初步驗(yàn)證

將收集的51份疑似患禽免疫抑制性和呼吸道疾病的青腳麻雞、白羽肉雞和烏雞的喉氣管、肺、腎、脾、肝、法氏囊組織，混合研磨勻漿后，滅菌的PBS勻漿稀釋，-70 ℃條件下反復(fù)凍融三次，4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min，取上清500 μL進(jìn)行RNA和DNA的提取。提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。分別用臨床樣品的PCR技術(shù)和基因芯片同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比兩者檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 靶基因的擴(kuò)增、克隆及重組質(zhì)粒菌復(fù)蘇鑒定

成功擴(kuò)增ALV-env、MDV-meq及IBDV-vp2靶基因片段，測(cè)序結(jié)果顯示，與NCBI中收錄的同一病毒的不同毒株靶基因序列具有99%以上的相似性(表3)。對(duì)ALV-env、MDV-meq、IBDV-vp2、AIV-np、NDV-f、ILTV-tk進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示(圖2)，PCR擴(kuò)增的目的片段與預(yù)期大小一致。

表3ALV-env、MDV-meq及IBDV-vp2靶基因的鑒定結(jié)果

Table3Identificationresultsoftargetgenes(ALV,MDVandIBDV)

靶基因Target gene長(zhǎng)度/bp Length位置/nt Location相似性/% Identity參考株收錄號(hào)Accession No.ALV-env312423—73499KF612340.1312359—67099JF913206.1MDV-meq512225—73699KT229640.1512225—73699HF546097.1IBDV-vp27431—71799JQ353503.1743605—1 34799KT381974.1

M. 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(2 000 bp DNA ladder)； 1. λ定位基因； 2. ALV-env；3. MDV-meq；4. IBDV-vp2；5. NDV-f；6. ILTV-tk；7. AIV-np；8.陰性對(duì)照M. Relative molecular mass (2 000 bp DNA ladder); 1. λ; 2. ALV-env; 3. MDV-meq; 4. IBDV-vp2; 5. NDV-f; 6. ILTV-tk; 7. AIV-np; 8. Negative control圖2 靶基因鑒定結(jié)果Fig.2 The identification results of target gene

2.2 基因芯片制備的初檢

2.2.1 陽性定位基因的檢測(cè) 以λDNA定位基因?yàn)槟０暹M(jìn)行靶基因擴(kuò)增標(biāo)記，將λDNA擴(kuò)增產(chǎn)物與含6種病毒探針的芯片進(jìn)行雜交，銀染顯色，肉眼觀察試驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果顯示陽性質(zhì)控λDNA定位基因雜交斑點(diǎn)明顯可見，陰性對(duì)照和其他探針斑點(diǎn)沒有可見雜交斑點(diǎn)(圖3)。表明本研究制備的醛基基片及陽性定位基因質(zhì)量可靠。

2.2.2 共檢芯片全基因的檢測(cè) 6種病毒6個(gè)探針基因的全部探針位點(diǎn)均可以看到明顯的雜交斑點(diǎn)，陽性對(duì)照斑點(diǎn)明顯，陰性對(duì)照沒有可見雜交斑點(diǎn)，表明制備的可視化共檢芯片、選用探針基因質(zhì)量可靠(圖4)。

圖3 定位基因的測(cè)定Fig.3 The result of located gene hybridization

圖4 全探針的測(cè)定Fig.4 Hybridization scanning of all probes

2.3 可視化基因芯片的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.3.1 特異性試驗(yàn)評(píng)價(jià) ALV-env、MDV-meq、IBDV-vp2、AIV-np、NDV-f和ILTV-tk單獨(dú)與可視化芯片雜交時(shí)只在芯片的相應(yīng)位置出現(xiàn)了肉眼可見的雜交斑點(diǎn)，且各個(gè)探針之間無非特異性雜交的情況。使用IBV-n基因擴(kuò)增產(chǎn)物與可視化芯片雜交后，芯片的相應(yīng)位置無肉眼可見雜交信號(hào)斑點(diǎn)，雜交結(jié)果呈陰性(圖5)。說明本試驗(yàn)構(gòu)建的基因芯片具有高的特異性。

2.3.2 敏感性試驗(yàn)評(píng)價(jià) 當(dāng)模板濃度為1 ng·μL-1、100 pg·μL-1、10 pg·μL-1時(shí)，在芯片相應(yīng)位置能夠看見明顯的雜交信號(hào)；當(dāng)模板濃度為1 pg·μL-1后，隨著模板濃度降低，部分靶基因的雜交信號(hào)不斷減弱。當(dāng)模板濃度為100 fg·μL-1，肉眼無法觀察到雜交信號(hào)(圖6)。說明該檢測(cè)芯片的最低檢測(cè)濃度是1 pg·μL-1。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)評(píng)價(jià) 在60 d內(nèi)，常溫和4 ℃ 條件下保存的芯片對(duì)雜交信號(hào)沒有明顯影響，檢測(cè)信號(hào)點(diǎn)明顯。隨著芯片保存時(shí)間的延長(zhǎng)，常溫條件下的芯片在75 d時(shí)，雜交信號(hào)斑點(diǎn)變得模糊，個(gè)別靶基因信號(hào)點(diǎn)消失。而4 ℃條件下的芯片在90 d時(shí)，雜交信號(hào)斑點(diǎn)出現(xiàn)模糊，個(gè)別靶基因信號(hào)點(diǎn)消失(圖7、8)。說明本研究建立的可視化芯片4 ℃ 條件下可保存75 d，常溫條件下保存60 d。

2.4 可視化基因芯片的臨床樣品檢測(cè)

將處理好的臨床樣品分別進(jìn)行PCR/RT-PCR和基因芯片檢測(cè)，結(jié)果顯示，ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV和ILTV的檢出率分別為7.8%、0%、2.0%、3.9%、11.8%、0%。其中混合感染ALV和AIV為3.9%，NDV和AIV為2.0%，ALV、AIV和IBDV為2.0%，ALV、NDV和AIV為2.0%。結(jié)果顯示，此六種病毒在四川地區(qū)的禽類中AIV單獨(dú)感染率較高，未檢測(cè)到MDV和ILTV感染的現(xiàn)象。與PCR檢測(cè)技術(shù)相比較，兩者檢測(cè)結(jié)果一致(表4)。

圖5 可視化基因芯片特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 The specificity test of the visual chip

3 討 論

基因芯片因具有高通量、特異性好、敏感性強(qiáng)和可機(jī)械化操作等優(yōu)勢(shì)，被廣泛地應(yīng)用于基因研究、藥物分析和疾病診斷中。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)為，在傳統(tǒng)的基因芯片基礎(chǔ)上，以ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV及ILTV為研究對(duì)象，引入鏈霉親和素標(biāo)記的納米金顯色技術(shù)，構(gòu)建一套能同時(shí)檢測(cè)這六種禽類病毒的可視化基因芯片。通過優(yōu)化基因芯片的檢測(cè)過程條件，建立標(biāo)準(zhǔn)化的可視化基因芯片檢測(cè)技術(shù)，并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)和臨床初步應(yīng)用評(píng)價(jià)，從而為促進(jìn)國內(nèi)家禽產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供技術(shù)支撐。

靶基因的選擇是芯片技術(shù)對(duì)病原微生物進(jìn)行快速、準(zhǔn)確診斷的前提。ALV的env基因與病毒的抗原性、組織親嗜性以及毒力密切相關(guān)，是ALV致腫瘤高度保守的關(guān)鍵基因[16]。meq基因?yàn)镸DV所特有保守的基因，與致瘤作用密切相關(guān)[17]。vp2是IBDV的宿主保護(hù)性抗原基因[18]。NDV的f基因是構(gòu)成NDV致病性的主要成分[19]。AIV的NP蛋白結(jié)構(gòu)高度保守，是細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞識(shí)別的主要抗原[7, 9, 20]。tk基因具有高度的保守性，被廣泛地用于ILTV中核酸探針的標(biāo)記基因[21]。在本研究中，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫，對(duì)編碼env(ALV)、meq(MDV)及vp2(IBDV)蛋白的保守序列設(shè)計(jì)引物，將所有克隆的靶基因片段，軟件DNAStar、BLAST比對(duì)分析后，與NCBI上的參考株可達(dá)99%以上的相似性，為下一步試驗(yàn)提供可靠性。

A. 1 ng·μL-1；B. 100 pg·μL-1；C. 10 pg·μL-1；D. 1 pg·μL-1； E. 100 fg·μL-1圖6 可視化基因芯片敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 The sensitivity results of visual chip

圖7 可視化基因芯片穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(常溫下)Fig.7 The retention period of visual chip(room temperature)

圖8 可視化基因芯片穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(4 ℃)Fig.8 The retention period of visual chip(4 ℃)

51份病料樣品中，AIV被檢出的感染率最高，達(dá)到11.8%。研究表明，疾病的感染與所處的季節(jié)息息相關(guān)，如9月，在所檢測(cè)的38份病料中，發(fā)現(xiàn)有11份病料同時(shí)感染NDV和AIV，而在同年的11月，在所檢測(cè)的32份病料中未檢測(cè)到NDV和AIV共感染現(xiàn)象，因此推測(cè)兩種病毒混合感染現(xiàn)象與病料的收集時(shí)間有關(guān)[22]。在本文的51份病料樣品內(nèi)，其中AIV和NDV被檢出同時(shí)感染的現(xiàn)象為2.0%，正恰好51份樣品大部分在秋冬采集，這可能與疾病的流行季節(jié)有關(guān)。檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步顯示，ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV和ILTV的檢出率分別為7.8%、0%、2.0%、3.9%、11.8%、0%。其中混合感染ALV和AIV為3.9%，NDV和AIV為2.0%，ALV、AIV和IBDV為2.0%，ALV、NDV和AIV為2.0%。這與常見文獻(xiàn)報(bào)道AIV、NDV和ALV存在混合感染現(xiàn)象相一致[23-24]。而在51份 樣品中未發(fā)現(xiàn)有四重或者五、六重感染情況，這可能與所采病料季節(jié)和地域有關(guān)。

表451份樣品的檢測(cè)結(jié)果

Table4Thedetectionresultsof51samples

感染類型Infection typePCR/RT-PCR (X)基因芯片(Y)Microattry (Y)ALV4/514/51MDV0/510/51IBDV1/511/51NDV2/512/51AIV6/516/51ILTV0/510/51ALV+AIV2/512/51NDV+AIV1/511/51ALV+AIV+IBDV1/511/51ALV+NDV+AIV1/511/51

數(shù)據(jù)以“陽性數(shù)/樣品數(shù)”的形式給出

The data are given in the form of “positive number / sample number”

在本試驗(yàn)中引入λDNA作為定位基因，來保證芯片制作過程的正確性。同時(shí)在前期方法建立的過程中，通過PCR方法擴(kuò)增目的基因，在構(gòu)建質(zhì)粒后測(cè)序驗(yàn)證目的基因的正確性，結(jié)果表明該P(yáng)CR方法可用于目的基因的擴(kuò)增。而在臨床病料檢測(cè)過程中，所使用的病料DNA提取方法和PCR過程均與前期方法完全一致，從而保證了臨床檢測(cè)PCR過程的正確性。然而，筆者也意識(shí)到使用GAPDH、β-actin等內(nèi)參基因能夠避免臨床檢測(cè)PCR假陰性出現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)[25]。在后續(xù)的試驗(yàn)過程中筆者會(huì)利用內(nèi)參基因?qū)Ρ痉椒ㄟM(jìn)行改進(jìn)。

4 結(jié) 論

構(gòu)建了同時(shí)檢測(cè)ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV和ILTV的金標(biāo)銀染可視化基因芯片，其病原檢出率和PCR技術(shù)的檢出率保持一致，能有效、快速、特異地同時(shí)區(qū)別禽類的六種病毒，并應(yīng)用于臨床檢測(cè)。這為基因芯片檢測(cè)在家禽疫病防控中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。