UHRF1通過調(diào)控細(xì)胞自噬抑制肺腺癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制研究

卞秀森 李 光 關(guān)欣宇 張 伊 狄 暢 馬 璨

肺腺癌(Lung adenocarcinoma)是非小細(xì)胞肺癌的一個(gè)病理亞型，其具有發(fā)病年齡低，高發(fā)于女性患者，嚴(yán)重威脅著人類的健康[1-2]。雖然隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，肺腺癌的治療方法已經(jīng)有了很大更新和進(jìn)步，但肺腺癌患者5年生存率仍然很低。因此探尋新的針對(duì)于肺腺癌預(yù)防、診斷、治療新的生物學(xué)標(biāo)記物成為了廣大呼吸科以及胸外科的重要著眼點(diǎn)。目前許多研究表明一些基因能夠在肺腺癌發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[3-4]，但是具有更強(qiáng)功能的基因在肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展中的生物學(xué)作用和機(jī)制仍需要深入的探討。泛素樣含PHD和環(huán)指結(jié)構(gòu)域1(UHRF1)是一種參與DNA甲基化的調(diào)控基因[5]。在UHRF1基因喪失功能時(shí)，發(fā)現(xiàn)其能夠?qū)е录?xì)胞DNA甲基化失活[6]。UHRF1的特點(diǎn)是廣泛表達(dá)，是DNA功能的重要調(diào)節(jié)因子[7]。以往的研究已經(jīng)證實(shí)，UHRF1通過DNA修復(fù)對(duì)于細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用，進(jìn)而抗凋亡。最近越來越多的研究發(fā)現(xiàn)UHRF1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌和其他腫瘤中發(fā)揮細(xì)胞周期調(diào)控的作用；表明UHRF1在腫瘤發(fā)生中起著重要的作用[8-9]。然而UHRF1在肺腺癌中的作用及其潛在的機(jī)制鮮有報(bào)道，有待進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 UHRF1基因數(shù)據(jù)

本研究通過http：//ualcan.path.uab.edu/index.html網(wǎng)站獲取了TCGA數(shù)據(jù)庫中UHRF1基因在肺腺癌患者的惡性腫瘤組織、癌旁組織中的表達(dá)，及UHRF1對(duì)于肺腺癌患者生存率的影響。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、PC-9和H1299培養(yǎng)于含有10%胎牛血清以及100 U/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中。人支氣管上皮細(xì)胞16HBE培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中。細(xì)胞的培養(yǎng)于含有5% CO2的37℃恒溫孵箱中。細(xì)胞密度達(dá)到75%～85%左右進(jìn)行傳代。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

使用UHRF1敲減試劑盒(stQ0010935-1)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，其序列為：siRNA UHRF1：5′-GCGCUGGCUCUCAACUGCU-3′，5′-AGCAGUUGAGCCAGCGC-3′；通過脂質(zhì)體3 000將含有20 nMUHRF1-siRNA以及Control-siRNA轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中，培養(yǎng)5 h后，棄去無血清培養(yǎng)基，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4 CCK-8細(xì)胞活性檢測

將UHRF1-siRNA以及其陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染到A549(2×103)細(xì)胞中48 h后，按照CCK-8說明書進(jìn)行操作，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒計(jì)算A549細(xì)胞存活率。細(xì)胞活力的百分比=(實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度)×100%。

1.5 克隆形成

將8×102A549細(xì)胞培養(yǎng)于6 cm培養(yǎng)皿中14天后。棄去培養(yǎng)基，并用PBS漂洗。用20%甲醇固定，用1%結(jié)晶紫染色。低倍鏡下，統(tǒng)計(jì)超過50個(gè)細(xì)胞組成的菌落計(jì)數(shù)為單個(gè)菌落。

1.6 Ki-67免疫熒光

A549細(xì)胞接種于鋪有無菌蓋玻片的6孔板中，分別轉(zhuǎn)染UHRF1-siRNA以及Control-siRNA 48 h后。將Ki-67抗體孵育1 h后，加入熒光顯色劑Alexa-488在室溫孵育20 min。然后，用DIPA染細(xì)胞核。通過免疫熒光顯微鏡進(jìn)行拍攝。

1.7 RNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR

采用Trizol試劑提取總RNA，利用Superscriptase II逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，實(shí)時(shí)定量PCR法檢測UHRF1 mRNA水平。實(shí)時(shí)定量PCR采用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒，采用ABI7500實(shí)時(shí)定量PCR儀，PCR擴(kuò)增條件為：95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸35 s，共30個(gè)循環(huán)。以下引物用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測：UHRF1-F：5′-ACAACGTGGCAAGGACTGC-3′；UHRF1-R：5′-GAGCTGGTTGAGGACGGTCT-3′；GAPDH-F：5′-CCTGCACCACCAACTGCTTA-3′；GAPDH-R：5′-GGCCATCCACAGTCTTCTGG-3′。

1.8 抗體和蛋白免疫印跡

利用含蛋白酶抑制劑和RIPA裂解液裂解細(xì)胞，4℃，13 500轉(zhuǎn)/分鐘離心12 min并收上清。利用BCA法進(jìn)行蛋白定量。通過10%～12% SDS-PAGE進(jìn)行分離等量蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。室溫5%脫脂牛奶封閉后1～1.5 h后，分別與一抗β-actin(1∶2000)，PCNA(1∶1000)、Rb(1∶1000)、UHRF1(1∶1000)，CDK6(1∶1000)以及Rb(1∶1000)孵育4℃過夜。PBST洗滌3次后。紅外熒光標(biāo)記的二級(jí)抗體孵育1 h。使用紅外成像系統(tǒng)檢測蛋白印跡帶，并使用Odyssey 3.0軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行定量。每組條帶β-actin作為內(nèi)參。

1.9 透射電鏡觀察自噬小體

將UHRF1-siRNA或Control-siRNA轉(zhuǎn)染48 h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS沖洗3遍。用0.25%胰酶消化A549細(xì)胞，室溫3 000轉(zhuǎn)/分鐘離心10 min收集細(xì)胞。加入4%戊二醛4℃固定。樣品送哈爾濱工業(yè)大學(xué)電鏡實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行檢測。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù)，使用GraphPad Prism 5.0軟件繪圖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較通過Student′st檢驗(yàn)，多組間比較使用方差分析(ANOVA)和Tukey′s方法進(jìn)行多重比較，肺腺癌患者生存期通過Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UHRF1在肺腺癌組織以及細(xì)胞中的表達(dá)及與患者生存率的關(guān)系

UHRF1基因在TCGA數(shù)據(jù)庫的肺腺癌與癌旁數(shù)據(jù)樣本中的結(jié)果顯示，腺癌組織中UHRF1的表達(dá)要顯著高于癌旁組織(P=0.0042)(圖1A)。且高表達(dá)UHRF1組的肺腺癌患者生存期較低(P=0.027)(圖1B)。通過免疫蛋白印記以及實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測了UHRF1在A549、PC-9以及H1299中的表達(dá)，結(jié)果顯示，UHRF1在A549、PC-9以及H1299的表達(dá)相對(duì)于16HBE明顯升高(P<0.05)，且A549中表達(dá)更為明顯(圖1C-D)，因此在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中我們主要探討UHRF1在A549為代表的肺腺癌細(xì)胞系中的作用。

圖1 UHRF1在肺腺癌組織中以及細(xì)胞系中的表達(dá)Figure 1 The expression of UHRF1 in lung adenocarcinoma tissues and cell linesNote：A.UHRF1 was significantly increased in lung adenocarcinoma tissues in comparison with the normal tissues；B.The survival curves of UHRF1 in lung adenocarcinoma patients；C.UHRF1 at the mRNA level was increased in lung adenocarcinoma tissues；D.UHRF1 at the protein level was increased in lung adenocarcinoma cell lines.

2.2 沉默UHRF1抑制A549細(xì)胞增殖

為進(jìn)一步研究UHRF1對(duì)于A549細(xì)胞增殖能力的影響。首先通過免疫蛋白印記以及實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測UHRF1的轉(zhuǎn)染效率(圖2A-B)。我們發(fā)現(xiàn)相對(duì)于對(duì)照組，UHRF1-siRNA組中UHRF1的表達(dá)明顯降低。為了進(jìn)一步驗(yàn)證UHRF1對(duì)A549細(xì)胞活性的影響，CCK-8以及克隆形成的結(jié)果表明(圖2C-D)，低表達(dá)UHRF1能夠使A549細(xì)胞活性降低，同時(shí)克隆形成的結(jié)果也證明了相同的結(jié)果。此外，我們驗(yàn)證了UHRF1對(duì)于A549細(xì)胞增殖能力的影響，Ki-67結(jié)果顯示，低表達(dá)UHRF1能夠抑制A549細(xì)胞的增殖(圖2E)。隨后我們通過Western blot方法檢測細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白PCNA、CDK6以及Rb的變化，我們發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)UHRF1能夠使PCNA、CDK6蛋白表達(dá)相對(duì)于其陰性對(duì)照組明顯降低，而Rb蛋白相對(duì)于對(duì)照組表達(dá)升高(圖2F)。因此，我們的研究結(jié)果表明，低表達(dá)UHRF1能夠在體外抑制肺腺癌A549細(xì)胞的增殖。

2.3 UHRF1介導(dǎo)自噬調(diào)控A549增殖

自噬是一種細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新的病理生理過程。為了進(jìn)一步驗(yàn)證UHRF1對(duì)于A549細(xì)胞增殖。我們首先檢測了自噬相關(guān)蛋白LC3-I、LC3-II以及Beclin-1的變化，同時(shí)采用透射電鏡觀察了低表達(dá)UHRF1對(duì)于A549細(xì)胞中自噬小體的變化。我們的結(jié)果顯示相對(duì)于對(duì)照組，低表達(dá)UHRF1能夠上調(diào)LC3-II/LC3-I的比率(圖3A)。同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)，沉默UHRF1能夠上調(diào)Beclin-1蛋白的表達(dá)(圖3B)。而透射電鏡顯示，相對(duì)于對(duì)照組，UHRF1-siRNA組中自噬小體的數(shù)量明顯增加(圖3C)。

圖2 沉默UHRF1抑制A549細(xì)胞增殖Figure 2 Silencing UHRF1 inhibited proliferation of A549 cellsNote：A and B.Transfection efficiency of UHRF1-siRNA；C.Knockdown UHRF1 decreased the viability of A549 cells；D.Knockdown UHRF1 decreased capability of colony formation in A549 cells；E.Ki-67 immunofluoresecence staining showed that silencing UHRF1 decreased the proliferative ability of A549 cells；F.The levels of Rb，PCNA and CDK6 proteins after transfect with UHRF1-siRNA or control-siRNA in A549cells.*P< 0.05 vs. control-siRNA or NC.

3 討論

UHRF1是一種包含多個(gè)功能域的模塊化蛋白質(zhì)[10]。在DNA復(fù)制過程中，集合和環(huán)指結(jié)構(gòu)域在DNA甲基化中起著至關(guān)重要的作用。大量的文獻(xiàn)證明了UHRF1廣泛參與到了癌癥的病理、生理學(xué)過程。在本研究結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)UHRF1基因在肺腺癌組織中的表達(dá)上調(diào)，證明UHRF1參與到了肺腺癌的病理過程。

越來越多的證據(jù)表明，UHRF1通過表觀遺傳機(jī)制調(diào)節(jié)基因表達(dá)，包括DNA甲基化、組蛋白甲基化、組蛋白去乙?；涂赡芙M蛋白泛素化[11-12]。以前的研究表明，過表達(dá)UHRF1能夠使斑馬魚DNMT1去穩(wěn)定，導(dǎo)致DNA甲基化[12]。此外，過表達(dá)UHFR1誘導(dǎo)了DNA的低甲基化，導(dǎo)致斑馬魚的肝細(xì)胞癌的發(fā)生[7]。在我們的研究中，敲除UHRF1能夠明顯抑制A549細(xì)胞活力，抑制A549細(xì)胞的增殖能力。但沉默UHRF1后是怎樣抑制A549細(xì)胞的增殖的作用的，以及其他潛在的分子機(jī)制將在我們后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中陸續(xù)展開。

目前已有研究證實(shí)，UHRF1基因能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬[13]。而自噬是一種在細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮重要功能的因子[14-15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在UHRF1低表達(dá)組中，能發(fā)現(xiàn)自噬小體數(shù)量明顯增多。而Beclin-1和LC3是自噬發(fā)生過程中的重要蛋白，其自噬發(fā)生的初級(jí)階段誘導(dǎo)自噬小體的形成。此外，UHRF1低表達(dá)組中，LC3-II/LC3-I的比率明顯升高，而Beclin-1蛋白表達(dá)也升高。由此我們推測，沉默UHRF1抑制A549細(xì)胞增殖是通過自噬產(chǎn)生的。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示UHRF1是通過調(diào)節(jié)自噬進(jìn)而影響肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549增殖的。本研究結(jié)果為UHRF1成為潛在治療肺腺癌的生物學(xué)標(biāo)記物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。