超聲波法提取水溶性茯苓多糖工藝優(yōu)化及其抗氧化活性探究

郭毓菲，張詩泉，王漢迪，李曉潔，曾百慧，胡 婷，向 福，吳 鵬*

（黃岡師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院 經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 黃岡 438000）

茯苓（Poria cocos）又稱茯靈，屬多孔菌科。九資河茯苓聞名中外，是一種名貴的中藥材，可安神、健脾，在治療水腫、腎炎方面有顯著功效。茯苓多糖主要存在于茯苓細(xì)胞壁中，具有促進(jìn)細(xì)胞分裂、補(bǔ)體激活、增強(qiáng)免疫力、抗炎、消除自由基、抗氧化、抗衰老及抗腫瘤等作用[1-5]，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮和乙醚等有機(jī)溶劑，具有抗炎、抗腫瘤和增強(qiáng)免疫等作用。

茯苓多糖的提取方法[6]主要有稀堿浸提法[4]、超聲波輔助酶法[7]、復(fù)合酶法[8]、發(fā)酵法[9]等，稀堿浸提法工藝流程復(fù)雜，操作較麻煩；發(fā)酵法耗時較長；復(fù)合酶-水浸提法必須嚴(yán)格控制變量。而超聲波由于其獨特的物理化學(xué)效應(yīng)，近年來被廣泛運(yùn)用于部分中藥材的多糖提取。該方法操作簡單方便、耗時短、提取率高。但目前茯苓多糖的提取無法達(dá)到工業(yè)化。

中藥多糖類物質(zhì)抗氧化作用研究報道較多[10-11]，羧甲基茯苓多糖抗氧化作用已見文獻(xiàn)報道[12]。本研究采用超聲波法提取茯苓多糖，并對其提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。同時通過測定茯苓多糖的總抗氧化力、1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率，對其抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為茯苓多糖的開發(fā)利用提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

九資河茯苓：市售。

苯酚重蒸餾試劑（純度80%）、濃硫酸（純度95.5%）、維生素C（vitaminC，VC）、氯化鐵、三氯乙酸、鐵氰化鉀、DPPH、葡萄糖（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TG16-WS臺式高速離心機(jī)：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；scientz-IIDM微波光波超聲波萃取儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；732型可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市順華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 茯苓多糖的提取

采用超聲波法提取茯苓多糖[4-5]。挑選成色較好的茯苓塊于（48±2）℃條件下恒溫干燥48h，打磨成粉狀，過篩80目，取樣品1 g與水按一定料液比溶解，放入超聲波萃取儀中于20℃條件下提取茯苓多糖（超聲波間歇時間為3 s），經(jīng)超聲波提取后于3000r/min條件下離心20 min，離心后取上清液進(jìn)行抽濾，抽濾液備用。

1.3.2 茯苓多糖的測定

采用苯酚-硫酸法測定茯苓多糖含量[13-14]。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖10 mg于250 mL容量瓶中，加水定容至刻度，分別吸取0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL、1.8 mL于小燒杯中，用蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL，然后分別加入1.0 mL 5%苯酚和5.0 mL濃硫酸，搖勻冷卻，置沸水浴顯色15 min后室溫冷卻，采用分光光度計測定波長490 nm處的吸光度值。用2.0mL蒸餾水作為空白對照，制得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.010 8x+0.004 2，R2=0.999，線性關(guān)系良好，說明可用于茯苓多糖得率的測定。

樣品中茯苓多糖含量的測定：取2 mL待測樣品，添加1.0 mL 6%的苯酚溶液，再加入5.0 mL濃硫酸，置沸水浴顯色15min后室溫冷卻，測定其在波長490nm處的吸光度值。

根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出茯苓多糖的提取量，進(jìn)而得出茯苓多糖的得率，其計算公式如下：

式中：w為茯苓總多糖得率，%；c為樣品液中葡萄糖質(zhì)量濃度，μg/mL；d為稀釋倍數(shù)；v為提取液總體積，mL；m為所稱樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 超聲波法提取水溶性茯苓多糖工藝優(yōu)化單因素試驗

超聲波功率對茯苓多糖得率的影響：準(zhǔn)確稱取處理好的樣品5份各1.0 g，按料液比1∶40（g∶mL）加入蒸餾水中，調(diào)節(jié)超聲波功率分別為150 W、175 W、200 W、225 W、250 W進(jìn)行超聲波提取，超聲時間為15 min，考察不同超聲波功率對茯苓多糖得率的影響。每組試驗重復(fù)3次。

料液比對茯苓多糖得率的影響：準(zhǔn)確稱取處理好的樣品5份各1.0 g，調(diào)節(jié)料液比分別為1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50（g∶mL）加入蒸餾水中，在超聲波功率200 W條件下進(jìn)行超聲波提取，超聲時間為15 min，考察不同料液比對茯苓多糖得率的影響。每組試驗重復(fù)3次。

超聲時間對茯苓多糖得率的影響：準(zhǔn)確稱取處理好的樣品5份各1.0 g，按料液比為1∶40（g∶mL）加入蒸餾水中，在超聲波功率200W條件下進(jìn)行超聲波提取，調(diào)節(jié)超聲時間為5 min、10 min、15min、20min、25min，考察不同超聲時間對茯苓多糖得率的影響。每組試驗重復(fù)3次。

1.3.4 超聲波法提取水溶性茯苓多糖工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗[16]

響應(yīng)面分析法將多因素試驗中因素與指標(biāo)的相互關(guān)系用多項式近似擬合，依此對函數(shù)的響應(yīng)面和等高線進(jìn)行分析，進(jìn)而研究因素與響應(yīng)面之間、因素與因素之間的相互關(guān)系[15，17-18]。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以茯苓多糖得率（Y）為響應(yīng)值，選擇超聲波功率（A）、料液比（B）、超聲時間（C）為影響因素設(shè)計響應(yīng)面試驗[19]，響應(yīng)面試驗的因素與水平見表1。

表1 茯苓多糖提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for extraction technology optimization of pachyman

1.3.5 茯苓多糖抗氧化活性探究

抗氧化能力[20]：取30支試管，依次加入0.2mol/L、pH=6.6的磷酸鈉緩沖溶液和1%鐵氰化鉀溶液各2.0 mL，分別加入不同質(zhì)量濃度（1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL、3.0 mg/mL）的樣品溶液和VC溶液2.0 mL，50℃恒溫水浴保溫20 min，取出后加入2.0 mL 10%三氯乙酸，振蕩搖勻，3 000 r/min離心15 min。吸取2.0 mL上清液于試管中，加入2.0 mL蒸餾水，再加入0.5 mL 0.1%氯化鐵，混合均勻后，于室溫條件下反應(yīng)10 min，在波長700 nm處測定吸光度值，每個質(zhì)量濃度作3組平行試驗。吸光度值越高，說明還原力越高。

DPPH自由基清除率：分別取不同質(zhì)量濃度（1.0mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL、3.0mg/mL）的樣品溶液和相同質(zhì)量濃度的VC2.0mL于試管中，加入2.0mL2×10-4mol/L的DPPH溶液，混合均勻，避光反應(yīng)30min，在波長513 nm處測定其吸光度值A(chǔ)1，同時測定不加樣品溶液的空白樣的吸光度值A(chǔ)0，每個質(zhì)量濃度作3組平行試驗。對DPPH自由基的清除率計算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波法提取水溶性茯苓多糖工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 超聲波功率對茯苓多糖得率的影響

超聲波功率對茯苓多糖得率的影響結(jié)果見圖1。

圖1 超聲波功率對茯苓多糖得率的影響。Fig.1 Effect of ultrasonic power on the yield of pachyman

由圖1可以看出，超聲波功率對茯苓多糖得率的影響很大。當(dāng)超聲功率在150～200 W范圍內(nèi)，茯苓多糖得率隨著超聲波功率的升高而增加；當(dāng)超聲波功率為200 W時，茯苓多糖得率達(dá)到最大，為1.74%；當(dāng)超聲波功率＞200 W之后，茯苓多糖得率隨著超聲波功率的升高而下降，分析原因可能是超聲波功率過高，破壞了多糖的結(jié)構(gòu)[17]，導(dǎo)致多糖得率降低。因此，超聲功率200 W為宜。

2.1.2 料液比對茯苓多糖得率的影響。

料液比對茯苓多糖得率的影響結(jié)果見圖2。

圖2 料液比對茯苓多糖得率的影響Fig.2 Effect of solid to liquid ratio on the yield of pachyman

由圖2可以看出，料液比影響茯苓多糖的得率。當(dāng)料液比在1∶30～1∶35（g∶mL）時，茯苓多糖得率隨著料液比的變化而增加；當(dāng)料液比為1∶35（g∶mL）時，茯苓多糖得率達(dá)到最大，為1.62%；當(dāng)料液比在1∶35～1∶50（g∶mL）時，茯苓多糖得率隨著料液比的變化而下降，分析原因可能是茯苓粉含量減小，提取出的多糖濃度減小。因此，料液比1∶35（g∶mL）為宜。

2.1.3 超聲時間對茯苓多糖得率的影響

超聲時間對茯苓多糖得率的影響結(jié)果見圖3。

圖3 超聲時間對茯苓多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the yield of pachyman

由圖3可以看出，超聲時間對茯苓多糖得率影響顯著。當(dāng)超聲時間在5～25 min范圍內(nèi)時，茯苓多糖得率隨著超聲功率的升高而減?。划?dāng)超聲時間為10 min時，茯苓多糖得率達(dá)到最大，為2.08%；當(dāng)超聲時間在10～30 min時，茯苓多糖得率隨著超聲時間的升高而下降；當(dāng)超聲時間＞15 min之后，超聲時間對茯苓多糖得率影響較小，因為超聲時間過長，影響了多糖的分子鏈，對多糖結(jié)構(gòu)造成了破壞[21]，致使得率降低。因此，超聲時間10min為宜。

2.2 超聲波法提取水溶性茯苓多糖工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以茯苓多糖得率（Y）為響應(yīng)值，采用Box-Behnken試驗設(shè)計對茯苓多糖得率影響顯著的3個因素超聲波功率（A）、料液比（B）、超聲時間（C）進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗分析，結(jié)果與分析見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 茯苓多糖提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of response surface experiments for extraction technology optimization of pachyman

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

采用Design-Expert軟件對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合[7，16]，得出茯苓多糖得率對超聲波功率（A）、料液比（B）及超聲時間（C）的二次多項回歸方程：

Y=-10.068 25+0.045 20A+3.955 00B+0.148 20C-9.600 00AB-7.200 00AC-1.940 00BC-1.056 00A2-3.920 00B2-3.000 00C2

由表3可知，該模型的P=0.007 1＜0.01，極顯著；失擬項P=0.798 1＞0.05，不顯著，表明該方程合理可靠。一次項A、B、C和交互項AB、AC、BC對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05），二次項B2、C2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），A2對結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。3個因素對茯苓多糖得率的影響主次順序為C＞A＞B，即超聲時間＞超聲波功率＞料液比。

由響應(yīng)面分析法求得超聲波提取茯苓多糖的最佳工藝條件為超聲波功率194.52 W、料液比1∶34.31（g∶mL）、超聲時間11.27 min，理論茯苓多糖得率為2.096%，考慮在實際操作上的方便性，將各因素修正為超聲波功率200 W、料液比1∶34（g∶mL）、超聲時間11 min。

2.2.2 驗證試驗

在最優(yōu)工藝條件下進(jìn)行驗證試驗，通過3次平行試驗，得出實際茯苓多糖得率為（2.084±0.012）%，與回歸方程預(yù)測值2.096%基本吻合，所以該模型有效。

2.2.3 交互項對茯苓多糖得率的影響

超聲波功率、料液比及超聲時間的交互作用對茯苓多糖得率影響的響應(yīng)面及等高線見圖4。

圖4 超聲波功率、料液比及超聲時間的交互作用對茯苓多糖得率影響的響應(yīng)面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between ultrasonic power,solid to liquid ratio and ultrasonic time on the yield of pachyman

由圖4可知，超聲波功率和料液比、料液比和超聲時間、超聲波功率和超聲時間對茯苓多糖得率的影響均不顯著（P＞0.05）。

2.3 茯苓多糖抗氧化活性測定結(jié)果

2.3.1 總抗氧化能力測定結(jié)果

茯苓多糖及VC的總抗氧化能力測定結(jié)果見圖5。

由圖5可知，當(dāng)茯苓多糖質(zhì)量濃度在1.0～3.0 mg/mL范圍內(nèi)，茯苓多糖的總抗氧化能力隨茯苓多糖質(zhì)量濃度的增大而增大。當(dāng)茯苓多糖質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL時，總抗氧化能力最高，即吸光度值最大，為0.219。與陽性對照品VC比較，茯苓多糖樣品的總抗氧化能力＜VC。

圖5 茯苓多糖的總抗氧化能力測定結(jié)果Fig.5 Determination results of total antioxidant capacity of pachyman

2.3.2 DPPH自由基清除能力測定結(jié)果

茯苓多糖及VC對DPPH自由基的清除率測定結(jié)果見圖6。

圖6 茯苓多糖DPPH自由基清除率測定結(jié)果Fig.6 Determination results of DPPH free radical scavenging rate of pachyman

由圖6可知，當(dāng)茯苓多糖質(zhì)量濃度在1.0～3.0 mg/mL范圍內(nèi)，茯苓多糖對DPPH自由基的清除能力并不明顯，且均＜20%。當(dāng)茯苓多糖質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時，茯苓多糖對DPPH自由基的清除率最大，達(dá)到13%。與陽性對照品VC比較，茯苓多糖的DPPH自由基清除率均＜VC。

3 結(jié)論

本研究以茯苓多糖得率為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面法對超聲波法提取水溶性茯苓多糖工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出最優(yōu)工藝條件：超聲波功率200 W、料液比1∶34（g∶mL）、超聲時間11 min。在此最優(yōu)提取條件下，茯苓多糖得率為2.08%。通過對茯苓多糖抗氧化活性的研究得出，當(dāng)茯苓多糖質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL時，總抗氧化能力最高，為0.22；當(dāng)茯苓多糖質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時，茯苓多糖對DPPH自由基的清除率最大，為13%，但均低于陽性對照VC。