青皮藥材的HPLC指紋圖譜建立及聚類(lèi)分析和主成分分析Δ

靳貝貝，裴香萍，梁惠珍

（山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，山西 晉中 030619）

青皮，亦稱青桔皮或青柑皮，為蕓香科植物橘（Citrus reticulataBlanco）及其栽培變種的干燥幼果或未成熟果實(shí)的果皮[1]。除用橘類(lèi)的未成熟果實(shí)的果皮外，其同屬植物甜橙（C.sinensisOsbeck）、香櫞（C.wilsoniiTanaka）以及茶枝柑（C.chachiensisHort）等柑類(lèi)未成熟果實(shí)的果皮在有的地區(qū)亦作青皮使用。青皮為常用中藥，味苦、辛，性微溫，具有破氣行痰、消痞除滿、理氣健脾、燥濕化痰等功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，青皮具有較好的升高血壓、抗休克等作用[2]，具有抗病毒、抗腫瘤及抗氧化等活性[3]，還可用于松弛胃腸和子宮平滑肌、促進(jìn)消化液分泌、利膽、祛痰平喘[4-6]等。揮發(fā)油類(lèi)、黃酮類(lèi)等是青皮的主要活性成分[7-8]。目前，2015年版《中國(guó)藥典》（一部）采用單一成分橙皮苷來(lái)控制青皮藥材的質(zhì)量[1]。本研究通過(guò)檢測(cè)10批青皮藥材樣品，建立其高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并結(jié)合聚類(lèi)分析、主成分分析對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，旨在為青皮藥材的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

e2695型HPLC儀，包括四元泵洗脫系統(tǒng)、自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、柱溫箱及光電二極管矩陣檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；SX-120DT型超聲波清洗機(jī)（上海圣訓(xùn)儀器有限公司）；AB-135型十萬(wàn)分之一電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；FA/JA1004型萬(wàn)分之一電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）。

1.2 試劑

橙皮苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110721-201617，純度：96.1%）；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

1.3 藥材

共收集青皮藥材樣品10批，經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院裴香萍副教授鑒定為蕓香科植物橘（C.reticulataBlanco）的干燥幼果或未成熟果實(shí)的果皮。青皮藥材樣品來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 青皮藥材樣品來(lái)源Tab 1 Origins of C.reticulata

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：XSelect?HSS T3-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.5%醋酸溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見(jiàn)表2）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution procedure

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取橙皮苷對(duì)照品5.50 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.11 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取藥材樣品粉末約0.2 g，置于50 mL量瓶中，加甲醇30 mL，超聲（功率：250 W，頻率：33 kHz）處理30 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)；取續(xù)濾液2 mL，置于5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20170508）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，以橙皮苷峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，11個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.08%，相對(duì)峰面積的RSD均小于1.22%（n＝6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20170508）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以橙皮苷峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，11個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.50%，相對(duì)峰面積的RSD均小于0.79%（n＝6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取藥材樣品粉末（批號(hào)：20170508）0.2 g，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以橙皮苷峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，11個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.50%，相對(duì)峰面積的RSD均小于2.97%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成與相似度評(píng)價(jià)、共有峰相關(guān)分析

圖1 10批藥材樣品的HPLC疊加指紋圖譜Fig 1 HPLC superimposed fingerprint of 10 batches of medicinal materials

圖2 藥材樣品的HPLC對(duì)照指紋圖譜Fig 2 HPLC control fingerprint of medicinal materials

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 分別取10批藥材樣品粉末0.2 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》對(duì)10批藥材樣品的HPLC圖譜進(jìn)行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見(jiàn)圖1、圖2。

2.4.2 相似度評(píng)價(jià) 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》，以藥材樣品的HPLC對(duì)照指紋圖譜為對(duì)照，進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，10批藥材樣品的相似度為0.919～1.000，表明各批藥材樣品的化學(xué)成分一致性較好，均含有11個(gè)成分，但各成分含量存在差異，詳見(jiàn)表3。

表3 10批藥材樣品相似度Tab 3 Similarity of 10 batches of medicinal materials

2.4.3 共有峰的指認(rèn)及相關(guān)分析 10批藥材樣品有11個(gè)共有峰，通過(guò)與對(duì)照品HPLC圖譜（詳見(jiàn)圖3）比對(duì)，指認(rèn)保留時(shí)間為25.588 min的6號(hào)峰為橙皮苷峰。其分離度良好，保留時(shí)間合適，故以其為參照峰，計(jì)算其他峰相對(duì)于該峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，詳見(jiàn)表4、表5。

圖3 對(duì)照品HPLC圖譜Fig 3 HPLC chromatogram of substance control

2.5 聚類(lèi)分析

以10批藥材樣品的11個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積為原始數(shù)據(jù)，采用SPSS 17.0軟件，以系統(tǒng)聚類(lèi)法結(jié)合歐氏距離（d）為測(cè)度進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，d＝20時(shí)，10批藥材樣品可聚為2類(lèi)，S4為一類(lèi)，其余聚為一類(lèi)；d＝5時(shí)，后一類(lèi)又可聚為2類(lèi)，S1、S10聚為一類(lèi)，S2、S3、S5～S9聚為一類(lèi)。

2.6 主成分分析

2.6.1 主成分因子特征值、方差貢獻(xiàn)率分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行主成分因子分析，其特征值和方差貢獻(xiàn)率見(jiàn)表6。由表6可知，以特征值＞1為標(biāo)準(zhǔn)，得到前2個(gè)主成分因子的特征值分別為8.237、1.935，方差貢獻(xiàn)率分別為75.206%、17.591%，累積方差貢獻(xiàn)率為92.797%＞85%。故采用前2個(gè)主成分因子為指標(biāo)對(duì)10批藥材樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)，詳見(jiàn)表7。由表7可知，主成分因子1可反映成分1、2、3、5、6、8、9、10、11的信息，主成分因子2可反映成分4、6、7的信息。

表4 10批藥材樣品HPLC圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間Tab 4 Relative retention time of common peaks for 10 batches of medicinal materials

表5 10批藥材樣品HPLC圖譜共有峰的相對(duì)峰面積Tab 5 Relative peak areas of common peaks for 10 batches of medicinal materials

圖4 10批藥材樣品聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖Fig 4 Cluster dendrogram for 10 batches of medicinal materials

表6 2個(gè)主成分因子的特征值和方差貢獻(xiàn)率Tab 6 Eigenvalue and variance contribution rate of two main component factors

以上述2個(gè)主成分因子為變量繪制載荷圖和得分圖，詳見(jiàn)圖5。由圖5可知，載荷圖結(jié)果與初始因子載荷矩陣結(jié)果相同，距離原點(diǎn)較遠(yuǎn)的點(diǎn)為主成分因子1和主成分因子2中權(quán)重值較大的成分；由得分圖可知，10批藥材樣品分散在不同區(qū)域，表明藥材樣品質(zhì)量與地域分布有關(guān)。

表7 初始因子載荷矩陣Tab 7 Primary factor loading matrix

圖5 10批藥材樣品的載荷圖和得分圖Fig 5 Loading diagram and score chart of 10 batches of medicinal materials

2.6.2 綜合質(zhì)量評(píng)分 以上述2個(gè)主成分因子對(duì)10批藥材樣品質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)表8。由表8可知，S7藥材樣品主成分因子綜合得分最高，該批樣品中成分1、2、5、6、9、10、11的含量相對(duì)較高，整體質(zhì)量相對(duì)較好綜合得分越高表示藥材樣品整體質(zhì)量越好[9]）。

表8 10批藥材樣品主成分因子得分及排序Tab 8 Main component factor score and ranking of 10 batches of medicinal materials

3 討論

當(dāng)前，隨著人們對(duì)中藥需求量的增大以及用藥安全意識(shí)的加強(qiáng)，中藥質(zhì)量控制越顯重要。指紋圖譜作為一種有效的中藥質(zhì)量控制模式，以其科學(xué)的理論依據(jù)獲得了國(guó)際上的一致認(rèn)可[10]。指紋圖譜在色譜峰未明確為何種成分的情況下，仍能給出充分、可靠的信息，用以控制中藥材質(zhì)量[11]。

本研究在建立青皮藥材的HPLC指紋圖譜的過(guò)程中曾分別考察了乙腈-0.5%醋酸溶液、乙腈-0.2%醋酸溶液、乙腈-水、甲醇-0.5%醋酸溶液、甲醇-0.2%醋酸溶液、甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)色譜峰的分離效果。結(jié)果，以乙腈-0.5%醋酸溶液為流動(dòng)相時(shí)分離效果最佳，色譜峰的分離度及峰形均良好，且保留時(shí)間合適，故最終選擇乙腈-0.5%醋酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。本研究還分別考察了在284、300、360 nm不同檢測(cè)波長(zhǎng)下的出峰情況。結(jié)果，檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm時(shí)的出峰數(shù)較多，故最終選擇360 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

本研究所建立的青皮藥材的HPLC指紋圖譜，可反映藥材樣品的特異性和整體性信息。在11個(gè)共有峰中，通過(guò)與對(duì)照品HPLC圖譜比對(duì)指認(rèn)出了橙皮苷峰。10批藥材樣品的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果表明，各批藥材樣品間質(zhì)量存在差異。各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD差異小，但相對(duì)峰面積的RSD相差較大，提示不同產(chǎn)地藥材樣品的成分雖一致，但含量差異較大，這可能與藥材的生長(zhǎng)環(huán)境、采收季節(jié)、加工炮制等因素有關(guān)。

綜上所述，本研究所建HPLC指紋圖譜及聚類(lèi)分析和主成分分析結(jié)果可為青皮藥材的質(zhì)量控制提供參考。