貴州小麥糯性基因多重 PCR 體系的優(yōu)化

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(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱糧研究所，貴陽(yáng) 550006； 2.貴州大學(xué)生命科學(xué)院，貴陽(yáng) 550025)

普通小麥(TriticumaestivumL.)胚乳中含有直鏈和支鏈2種淀粉。其中顆粒結(jié)合淀粉合成酶Ⅰ(Granules-bound starch synthaseⅠ,GBSS Ⅰ)，又稱(chēng)Wx蛋白，由蠟質(zhì)基因控制合成，是禾谷類(lèi)作物控制直鏈淀粉合成的關(guān)鍵酶。普通六倍體小麥(Triticum aestivum L.，AABBDD)含有3個(gè)蠟質(zhì)基因位點(diǎn)：位于染色體7 AS的Wx-A1、4 AL的Wx-B1和 7 DS的Wx-D1[1-2]。后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)了3種Wx基因的缺失型Wx-A1b、Wx-B1b和Wx-D1b，則相對(duì)的野生型基因型則為Wx-A1a、Wx-B1a和Wx-D1a。小麥中Wx蛋白控制著小麥籽粒中直鏈淀粉的合成，其Wx基因的缺失使小麥胚乳中直鏈淀粉的含量下降，因此，小麥胚乳表現(xiàn)出糯性[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，任何一種Wx蛋白亞基的缺失都能改變小麥的直鏈淀粉合成，3個(gè)Wx基因蛋白亞基全缺失的小麥稱(chēng)為全糯小麥，1個(gè)或2個(gè)Wx基因蛋白亞基缺失，會(huì)造成直鏈淀粉的合成受到影響，支鏈淀粉含量升高，稱(chēng)為部分糯小麥[5]。而全糯小麥幾乎不含直鏈淀粉或者含量極低(<1%)[6]。

目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者已開(kāi)發(fā)出鑒定3個(gè)糯質(zhì)基因的STS標(biāo)記和SSR標(biāo)記，并且Wx-A1基因的STS標(biāo)記已成功用于澳大利亞優(yōu)質(zhì)面條[7-10]。劉迎春等[11]在揚(yáng)麥10與關(guān)東107的雜交后代中，利用引物MAG 264和MAG 269分別篩選出Wx-A1、Wx-D1缺失型的部分糯性小麥，并得出MAG 264、MAG 269分別是Wx-A1、Wx-D1兩者的專(zhuān)一性PCR標(biāo)記。任麗娟等[12]用SSR標(biāo)記，同時(shí)對(duì)小麥的3個(gè)Wx基因位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，在雜交后代中獲得4株全糯小麥。鄧萬(wàn)洪等[13]利用序列標(biāo)志位點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)，對(duì)中國(guó)核心小麥種質(zhì)品種進(jìn)行分析，并用SDS-PAGE進(jìn)行驗(yàn)證，篩選出了Wx-B1基因缺失型小麥。近年來(lái)，利用基于PCR的多重PCR技術(shù)對(duì)基因進(jìn)行檢測(cè)的分子標(biāo)記技術(shù)不斷被應(yīng)用在小麥的糯性檢測(cè)中，盧龍斗等[14]通過(guò)在一個(gè)PCR體系中加入2對(duì)引物，分別對(duì)3個(gè)糯質(zhì)基因進(jìn)行擴(kuò)增，成功在矮抗與糯麥1902的后代群體中，分離得出Wx-A1、Wx-D1突變型各2株，Wx-B1突變型3株，同時(shí)缺失Wx-B1，Wx-D1基因的2株，Wx-A1，Wx-B1兩者都缺失的1株，3個(gè)基因都缺失的1株。這些利用多重PCR檢測(cè)小麥糯質(zhì)基因的實(shí)驗(yàn)。為后來(lái)學(xué)者采用多重PCR檢測(cè)小麥糯質(zhì)基因奠定了基礎(chǔ)。

表1 引物序列及其擴(kuò)增片段大小

基因名稱(chēng)引物名稱(chēng)引物序列(5'→3')擴(kuò)增片段大小(bp)參考文獻(xiàn)Wx-D1a/bMAG269FCGAGCGGCTACTCAAGAGCMAG269RGGCGGTCATCTGTCATTTCC1400/800劉迎春[11]Wx-B1a/bBRDCTGGCCTGCTACCTCAAGAGCAACTBFDLCTGACGTCCATGCCGTTGACGA-/425Nakamura et al[20]Wx-A1a/bMAG264FCCAAAGCAAAGCAGGAAACCMAG264RTACCTCGGAGATGACGCTGG336/317劉迎春[ 11]

糯小麥中支鏈淀粉含量高，糊化起始溫度低，黏度大，具有良好的抗老化特性，制作耐冷藏的速凍食品，以及延長(zhǎng)面包類(lèi)制品的貨架壽命[15]；糯小麥淀粉凝膠表面酥脆、淀粉糊透明度、凍融穩(wěn)定性好[16]；糯小麥淀粉比普通小麥淀粉具有高含量的蛋白質(zhì)和濕面筋，而且糯小麥淀粉還具有延伸性好、持水性能力強(qiáng)、其面團(tuán)的粘性大等優(yōu)點(diǎn)[17]；在造紙業(yè)和食品工業(yè)中具有很大的應(yīng)用前景[18]。糯小麥不僅可以作為主食食用，而且在釀酒上也有很大的應(yīng)用前景，趙國(guó)軍等[21]對(duì)糯小麥的釀酒特性進(jìn)行研究，得出糯小麥的出酒率比普通小麥和高粱的出酒率都高，因此具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[16-19]。

本研究利用多重PCR結(jié)合田間農(nóng)藝性狀調(diào)查的方法對(duì)渝糯麥5號(hào)、自育品系4 th 6008以及雜交F3代的72個(gè)單株的糯性蛋白基因進(jìn)行鑒定，利用與小麥糯質(zhì)基因(Wx-A1a，Wx-B1a和Wx-D1a)連鎖的3個(gè)特異分子標(biāo)記MAG 264、BDFL/BRD、MAG 269對(duì)其小麥品種(系) 中Wx 蛋白亞基分布的多態(tài)性；驗(yàn)證貴州小麥品種(系)Wx基因特異分子標(biāo)記的有效性；利用有效的分子標(biāo)記構(gòu)建Wx基因多重 PCR 體系，為分子標(biāo)記輔助選擇提供快速有效的方法，提高小麥淀粉品質(zhì)評(píng)價(jià)和糯小麥選育的效率。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本實(shí)驗(yàn)采用小麥系為實(shí)驗(yàn)材料，由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥課題組提供。

1.2 多重PCR引物

通過(guò)搜索文獻(xiàn)，篩選MAG 269、MAG 264和BRD/BFDL對(duì)Wx基因位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記，其引物序列和PCR預(yù)期擴(kuò)增條帶如表1，引物序列由上海生物工程科技有限公司合成。

1.3 DNA的提取

種子發(fā)芽進(jìn)行幼苗培養(yǎng)，取新鮮葉片，采用CTAB法提取總基因組，略做修改，提取的DNA 樣品稀釋到100 ng/μL備用。

1.4 Wx-A 1、Wx-B 1、Wx-D 1位點(diǎn)的單重PCR鑒定

PCR反應(yīng)體系(20μL)：10×Buffer 2.0μL，2.5 mM dNTP Mixture 0.4μL，每種引物各0.2，0.5，0.7μL，Template DNA 2.2μL，rTaqDNA Polymerase 0.11μL，補(bǔ)ddH2O 20μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，退火溫度每個(gè)循環(huán)降低0.4 ℃，35個(gè)循環(huán)，即從第1次循環(huán)時(shí)的66 ℃降到最后1次循環(huán)的52 ℃，然后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。 PCR擴(kuò)增在MJ Research PTC-200型PCR儀上完成。取4μL擴(kuò)增后的產(chǎn)物在8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，l×TBE緩沖液，100 W恒功率下，電泳1 h分離PCR產(chǎn)物，銀染，銀染后凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)、照相。

1.5 多重PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)

3個(gè)Wx蛋白亞基基因標(biāo)記的多重PCR體系及反應(yīng)條件參照張曉科設(shè)定的條件，進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化，反應(yīng)體系及條件如表2所示。PCR擴(kuò)增程序采用touchdown體系，退火溫度每個(gè)循環(huán)降低0.2 ℃，44個(gè)循環(huán)，即從第2次循環(huán)時(shí)的66 ℃降到最后1次循環(huán)的57.4 ℃，然后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增在MJ Research PTC-200型PCR儀上完成。取4μL擴(kuò)增后的產(chǎn)物在8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，l×TBE緩沖液，160 V恒壓下，電泳1～1.5 h分離PCR產(chǎn)物，銀染，銀染后凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)、照相。

圖1 MAG 264、BRD/BFDL、MAG 269單重PCR圖

表2 多重PCR反應(yīng)和電泳條件

項(xiàng)目名稱(chēng)多重PCR體系基因標(biāo)記Wx-A1、Wx-B1、Wx-D1PCR反應(yīng)體系25μLrTaq DNA Polymerase0.5μL2.5mM dNTP Mixture2.3μL10μmol/μL引物濃度0.68/0.5/0.68PCR擴(kuò)增條件預(yù)變性94℃,5min,變性94℃,50s退火66～57.4℃(-0.2℃/第2個(gè)循環(huán)),50s延伸72℃,1min 20s循環(huán)數(shù)44最后延伸72℃,7min電泳條件Native-PAGE(%)8電壓(V)160時(shí)間(h)1～1.5

2 結(jié)果與分析

2.1 單重PCR的檢測(cè)

野生型Wx-A1a基因序列比突變型Wx-A1b的核酸序列多19 bp。利用 Wx-A 1位點(diǎn)特異性引物在隨機(jī)選取的樣本中僅擴(kuò)增出317 bp帶，不能擴(kuò)出 336 bp條帶。從圖1-A可看出，在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠中，條帶較清晰，分辨率較好。

Wx-B 1位點(diǎn)特異性引物BRD/BFDL,從野生型材料Wx-B 1 a 位點(diǎn)擴(kuò)增出425 bp條帶，卻不能從突變型材料Wx-B1b基因型中擴(kuò)增出 425 bp條帶。從圖1-B可看出，雖然PCR反應(yīng)條件簡(jiǎn)單，但未擴(kuò)增出425 bp的條件，說(shuō)明該材料為Wx-B 1的缺失型植株。

由于劉迎春設(shè)計(jì)的突變型Wx-B 1 b 基因的3′序列缺失位置設(shè)計(jì)引物，因此，在野生型Wx-B 1 a植株中擴(kuò)增片段為1 400 bp，在突變型Wx-B 1 b植株中擴(kuò)增片段大小為800 bp。從圖1-C可看出，在隨機(jī)選取的樣本中均能擴(kuò)增出800 bp的條帶，且條帶清晰，說(shuō)明該植株為Wx-D 1的缺失型植株。

2.2 多重PCR檢測(cè)結(jié)果

Wx-A 1位點(diǎn)在野生型(Wx-A1a) 中擴(kuò)增出336 bp 條帶，在突變型(Wx-A1b)中擴(kuò)增出317 bp 條帶；Wx-B 1位點(diǎn)擴(kuò)增結(jié)果會(huì)出現(xiàn)多個(gè)條帶，425 pb條帶是判斷是否含有Wx-B 1突變的糯質(zhì)基因Wx-B1b，在突變型(Wx-B1b)中Wx-B1基因擴(kuò)增出425 bp條帶，而在野生型中擴(kuò)增不出該條帶。若擴(kuò)增出1 400 bp條帶，則為Wx-D 1野生型，800 bp條帶則為Wx-D 1突變型(圖3)；Wx-D 1位點(diǎn)標(biāo)記在野生型(Wx-D1a)中擴(kuò)增出1 400 bp 的條帶，在突變型(Wx-D1b)中擴(kuò)增出 800 bp 條帶。在圖3多重PCR體系隨機(jī)檢測(cè)的 10個(gè)材料中(圖 2)，1，3，5，6，8，9號(hào)泳道都擴(kuò)增出了800 bp 條帶，說(shuō)明Wx-D 1 位點(diǎn)為Wx-D1b等位基因，其余產(chǎn)生1 400 bp條帶，為野生型Wx-D1a。同時(shí)，1，3，5，6，8，9號(hào)材料都能擴(kuò)增出371 bp、425 bp、800 bp三條帶，為缺失型的全糯小麥。2，4，7，10號(hào)泳道同時(shí)擴(kuò)增出317 bp、425 bp的條帶，為Wx-A 1、Wx-B 1的缺失型。

圖2 糯性基因多重PCR體系優(yōu)化圖

2.3 小麥基因位點(diǎn)

a為野生型，b為突變型；Wx-A 1野生型的基因型：A- ，Wx-A 1野生型的基因型為aa ；Wx-B 1野生型的基因型：B-，Wx-B 1突變型的基因型：bb；Wx-D 1野生型的基因型：D-，Wx-D 1突變型的基因型：dd。

表3 F3代72株基因位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

編號(hào)Wx-A1Wx-B1Wx-D1基因型表現(xiàn)型1bbbaabbdd全糯2bbbaabbdd全糯3bbaaabbD-部分糯4abbA-bbdd部分糯5abbA-bbdd部分糯6bbaaabbD-部分糯7bbbaabbdd全糯8bbaaabbD-部分糯9aabA-B-dd部分糯10bbbaabbdd全糯11bbbaabbdd全糯12bbaaabbD-部分糯13bbaaabbD-部分糯14bbbaabbdd全糯15abbA-bbdd部分糯16abbA-bbdd部分糯17bbbaabbdd全糯18abbA-bbdd部分糯19bbaaabbD-部分糯20bbaaabbD-部分糯21bbbaabbdd全糯22bbaaabbD-部分糯23bbaaabbD-部分糯24bbbaabbdd全糯25bbbaabbdd全糯26abbA-bbdd部分糯27abaA-bbD-部分糯28abbA-bbdd-部分糯29bbbaabbdd全糯30bbbaabbdd全糯31bbbaabbdd全糯32bbbaabbdd全糯33bbbaabbdd-全糯34abbA-bbdd部分糯35abbA-bbdd部分糯36bbaaabbD-部分糯37abaA-bbD-部分糯38abbA-bbdd部分糯39abbA-bbdd部分糯40bbbaabbdd全糯41abaA-bbD-部分糯42abbA-bbdd部分糯43abbA-bbdd部分糯

續(xù)表3

編號(hào)Wx-A1Wx-B1Wx-D1基因型表現(xiàn)型44bbbaabbdd全糯45bbbaabbdd全糯46bbbaabbdd全糯47bbaaabbD-部分糯48bbbaabbdd全糯49bbbaabbdd全糯50bbbaabbdd全糯51bbbaabbdd全糯52bbbaabbdd全糯53bbbaabbdd全糯54bbbaabbdd全糯55aAbA-B-dd部分糯56bbbaabbdd全糯57abbA-bbdd部分糯58bbbaabbdd全糯59bbaaabbD-部分糯60bbbaabbdd全糯61bbbaabbdd全糯62bbaaabbD-部分糯63abbA-bbdd部分糯64bbbaabbdd全糯65abaA-bbD-部分糯66bbbaabbdd全糯67baaaaB-D-部分糯68bbaaabbD-部分糯69aabA-B-bb部分糯70abbA-bbdd部分糯71bbbaabbdd全糯72bbbaabbdd全糯

2.4 F3代群體中糯質(zhì)小麥頻率

對(duì)72個(gè)F3代分離群體中有34(47.22%)株小麥在800 bp、425 bp、317 bp同時(shí)擴(kuò)增出三條帶，即Wx-A1、Wx-B1、Wx-D1同時(shí)缺失型的全糯小麥；擴(kuò)增出317 bp、425 bp片段的有14株(19.44%)Wx-A1、Wx-B1缺失型；同時(shí)擴(kuò)增出800 bp、425 bp的Wx-B1、Wx-D1缺失型的有16株(22.22%)；只擴(kuò)增425 bp的Wx-B1基因缺失型的4株(5.56%)和只擴(kuò)增800 bp的Wx-D1基因缺失型的3株(4.17%)以及只擴(kuò)增出316 bp的Wx-A1基因缺失型的1株(1.39%)。

3 討 論

普通小麥中直鏈淀粉含量為22%～25%，籽粒中直鏈淀粉和支鏈淀粉含量的比例受不同的Wx蛋白亞基的影響，Wx 蛋白亞基通常采用2 D-SDS-PAGE 和1 D-SDS-PAGE進(jìn)行電泳檢測(cè)分離，但操作繁瑣，難度大。后續(xù)出現(xiàn)改良后的1 D-SDS-PAGE 分離并分析 Wx 蛋白的亞基構(gòu)成，簡(jiǎn)便、快速，適用于小麥育種中對(duì) Wx 蛋白類(lèi)型的初步篩選。同時(shí)，由于Wx-B 1 和 Wx-D 1 亞基的分子量、等電點(diǎn)相近，運(yùn)用SDS-PAGE不易區(qū)分。Wx蛋白分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用，不僅提高育種效率，而且使分子標(biāo)記輔助育種在小麥育種中得到應(yīng)用。目前國(guó)內(nèi)外已開(kāi)發(fā)了大量的SSR、STS- PCR和分別檢測(cè)WxA1和Wx-D1a的 CAPS 和 dCAPS標(biāo)記，梁榮奇等[21]應(yīng)用SSR標(biāo)記對(duì)江蘇白火麥回交改良群體中個(gè)體進(jìn)行輔助選擇，得到了含Wx-D1b的7 D單體，為將來(lái)進(jìn)一步改良糯性小麥的農(nóng)藝性狀提供廣泛的遺傳材料。

宋建民等[22]根據(jù)Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1的3個(gè)位點(diǎn)基因序列和變異情況分別設(shè)計(jì)了PCR引物，但設(shè)計(jì)的 Wx-B 1位點(diǎn)引物，以及劉迎春等[11]建立專(zhuān)一檢測(cè)Wx-A 1位點(diǎn)和Wx-D 1位點(diǎn)的PCR標(biāo)記MAG 264和MAG 269。

本研究利用與小麥糯質(zhì)基因(Wx-A1a，Wx-B1a和Wx-D1a)連鎖的3個(gè)特異分子標(biāo)記MAG 264、BDFL/BRD、MAG 269，對(duì)F3代分離群體進(jìn)行分子標(biāo)記，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰易辯，操作簡(jiǎn)單，效率高，并且，由于Wx-A 1和 Wx-D 1采用的是共顯性標(biāo)記，能夠清晰的明確雜交后代的基因型，避免了顯引物擴(kuò)增中出現(xiàn)的假陰性問(wèn)題。而鑒定Wx-B 1位點(diǎn)采用的是顯性標(biāo)記，避免因片段缺失出現(xiàn)誤差。并且，Wx基因在對(duì)應(yīng)的標(biāo)記位點(diǎn)都有相對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，適用于Wx基因共分離的分子標(biāo)記技術(shù)，結(jié)合傳統(tǒng)育種手段，對(duì)雜交后代材料中的糯性基因進(jìn)行跟蹤選擇，選育綜合性狀優(yōu)良、適合貴州生態(tài)氣候、可用于生產(chǎn)推廣的糯性小麥新材料，加快新品種選育效率。