學(xué)習(xí)記憶障礙動物模型及行為學(xué)檢測指標(biāo)的評析

羅燕，陳真

（中國藥科大學(xué)藥學(xué)醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，江蘇南京 211198）

隨著社會的進(jìn)步、人口老齡化的發(fā)展、生活方式的改變、環(huán)境的惡化以及社會競爭壓力的增大，阿爾茨海默病、血管性癡呆、抑郁癥等神經(jīng)性相關(guān)疾病的發(fā)生概率大大增加，而這些神經(jīng)性相關(guān)疾病都伴隨著學(xué)習(xí)記憶障礙。有資料預(yù)測，截止到2050年美國癡呆人口數(shù)量將由450萬上漲到1.14億［1］。學(xué)習(xí)記憶障礙模型和行為學(xué)檢測方法是新藥研發(fā)中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。因此構(gòu)建學(xué)習(xí)記憶障礙動物模型以及完善行為學(xué)檢測方法，以期更好的研發(fā)出治療學(xué)習(xí)記憶障礙藥物顯得極其重要。針對目前國內(nèi)實(shí)驗(yàn)者在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃蜋z測指標(biāo)時(shí)的選擇困惑，筆者在文獻(xiàn)檢索的基礎(chǔ)上，對以下模型和檢測指標(biāo)進(jìn)行了對比性實(shí)驗(yàn)，得出了一些收獲與體會，總結(jié)如下。

1 學(xué)習(xí)記憶障礙模型的構(gòu)建

目前學(xué)習(xí)記憶障礙的發(fā)病機(jī)制大致可分為以下5個(gè)類別：腦外傷引起記憶受損；腦內(nèi)的β-淀粉樣失衡、膽堿能失衡、蛋白合成異常、基因表達(dá)異常導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶障礙；腦缺血缺氧導(dǎo)致自由基損傷、鈣平衡失調(diào)、興奮性毒性及神經(jīng)細(xì)胞死亡而誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶障礙；衰老導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的自然老化引起學(xué)習(xí)記憶功能衰退；精神、心理異常導(dǎo)致的皮層萎縮促使學(xué)習(xí)記憶障礙發(fā)生。構(gòu)建學(xué)習(xí)記憶障礙模型主要從記憶的3個(gè)階段入手，即破壞記憶的獲取、鞏固、再現(xiàn)。目前國內(nèi)外常用的學(xué)習(xí)記憶障礙動物模型的構(gòu)建方法如下。

1.1 東莨菪堿誘導(dǎo)的記憶獲得障礙 東莨菪堿是一種非選擇性M膽堿能受體抑制劑，它能夠阻斷膽堿能信號通路，抑制乙酰膽堿傳遞從而減弱海馬的長時(shí)增效［2］。此模型主要用于篩選作用于膽堿能受體的藥物，由于東莨菪堿對動物的損傷是可逆的，只能部分模擬阿爾茨海默病的病癥，這就限制了該模型的發(fā)展。訓(xùn)練前腹腔注射3 mg·kg－1的東莨菪堿，給藥10 min后對雌雄小鼠皆可造成記憶獲得障礙［3］。

1.2 亞硝酸鈉誘導(dǎo)的記憶鞏固障礙 亞硝酸鈉是一種腦缺氧劑，進(jìn)入機(jī)體后會造成機(jī)體產(chǎn)生高鐵血紅蛋白血癥。高鐵血紅蛋白與羥基結(jié)合會造成其不能與氧結(jié)合，從而導(dǎo)致腦缺氧，進(jìn)而引起腦內(nèi)一些神經(jīng)遞質(zhì)，如 γ-氨基丁酸（GABA）、多巴胺（DA）、乙酰膽堿的濃度失衡，以及神經(jīng)元的可塑性改變和壞死［4］。訓(xùn)練后立即單次腹腔注射亞硝酸鈉120 mg·kg－1即可構(gòu)建小鼠記憶鞏固障礙模型［5］。

1.3 乙醇誘導(dǎo)的記憶再現(xiàn)障礙 乙醇是一種中樞性抑制劑，會導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的細(xì)胞產(chǎn)生毒性反應(yīng)［6］。乙醇可通過影響注意力、自控功能、情緒等來誘發(fā)學(xué)習(xí)記憶障礙［7］。乙醇可使脂質(zhì)過氧化、活性氧大量累積促使氧化應(yīng)激最終損害膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)［8］。在測試前30 min灌胃低濃度的乙醇即可明顯破壞記憶過程，造成學(xué)習(xí)記憶再現(xiàn)障礙［9］。

1.4 D-半乳糖誘導(dǎo)的記憶再現(xiàn)障礙 D-半乳糖亞急性衰老模型是在一定時(shí)間內(nèi)連續(xù)皮下注射大劑量D-半乳糖，引起糖代謝紊亂導(dǎo)致腦細(xì)胞受損。高劑量的D-半乳糖一方面在半乳糖氧化酶的作用下生成乙醛糖和過氧化氫，促使超氧陰離子和氧自由基大量產(chǎn)生，大量的自由基使脂質(zhì)過氧化物形成，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙，使細(xì)胞代謝功能下降，從而發(fā)生一系列與老化相似的病理變化［10-11］；另一方面在游離氨基的協(xié)作下使蛋白和多肽的結(jié)構(gòu)改變，通過非酶糖化作用促使晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）累積，最終導(dǎo)致腦內(nèi)氧化損傷［12］。4周內(nèi)每天給予120 mg·kg－1D-半乳糖即可構(gòu)建學(xué)習(xí)記憶障礙模型［13］。

1.5 β淀粉樣蛋白（Aβ）沉積誘導(dǎo)的記憶障礙Aβ是由Aβ前體蛋白（APP）水解而來的多肽，能夠抑制乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶的活性進(jìn)而導(dǎo)致膽堿能神經(jīng)失衡［14］。腦內(nèi)過量的Aβ沉積會促使神經(jīng)元細(xì)胞變性、炎性反應(yīng)發(fā)生、氧化應(yīng)激、tau蛋白高度磷酸化形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［15］。Aβ沉積同時(shí)會影響鉀離子通道、NMDA受體、電壓門控性鈣通道等離子通道的開放，最終促使鈣平衡失調(diào)引發(fā)學(xué)習(xí)記憶障礙［16］。在鼠的第三腦室注射Aβ后，Aβ在腦區(qū)域內(nèi)累積造成學(xué)習(xí)記憶障礙，這種學(xué)習(xí)記憶損傷方式與阿爾茲海默病的形成方式高度類似［17］。

2 學(xué)習(xí)記憶障礙模型的行為學(xué)檢測方法及評析

行為學(xué)檢測是基于條件反射的一種實(shí)驗(yàn)方法，目前國內(nèi)應(yīng)用較為廣泛的是以被動逃避條件反射為基礎(chǔ)的跳臺法、Y迷宮法、避暗法以及Morris水迷宮法。

2.1 跳臺法 裝置大小為10 cm×10 cm×60 cm，平均分成5間，底面是可以通36 V連續(xù)電刺激的銅柵，每個(gè)反應(yīng)箱內(nèi)右后角置一高度和直徑均為4.5 cm的平臺。

訓(xùn)練時(shí)將小鼠于測試箱內(nèi)適應(yīng)環(huán)境3 min后，確定小鼠均位于銅柵后，立即通電，受電擊后，小鼠跳到安全平臺躲避電擊。記錄小鼠第一次跳上跳臺的反應(yīng)時(shí)間（學(xué)習(xí)潛伏期）和5 min內(nèi)受到的電擊次數(shù)（學(xué)習(xí)錯(cuò)誤次數(shù)），這兩項(xiàng)為學(xué)習(xí)成績。測試時(shí)，小鼠放于跳臺上，記錄小鼠第一次跳下跳臺的時(shí)間（記憶潛伏期）和5 min內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)，5 min內(nèi)未跳下跳臺的小鼠其潛伏期按300 s計(jì)算，這兩項(xiàng)為記憶成績［18］。

跳臺法優(yōu)缺點(diǎn)：裝置簡單易操作，靈敏度高，能同時(shí)操作5只動物，較好地進(jìn)行組間平行實(shí)驗(yàn)。缺點(diǎn)是當(dāng)動物站立在同一根刺激電極時(shí)，足底逃避電擊，出現(xiàn)誤差；電刺激對動物損傷大；動物個(gè)體差異大，需加大樣本量或進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選。

2.2 Y迷宮法 由3條等長的臂和其交界區(qū)組成，底面有等距的電柵，內(nèi)側(cè)壁貼有導(dǎo)電的銅片，各臂末端均裝有刺激信號燈。控制面板由電壓顯示區(qū)、電壓調(diào)節(jié)旋鈕和“Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、0”4個(gè)按鍵組成。按下Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ鍵時(shí)，所對應(yīng)臂的刺激信號燈亮，此時(shí)該臂為安全區(qū)，不亮燈的兩臂及交界區(qū)在2 s后均通電成為非安全區(qū)。按下0鍵，只有交界區(qū)通電。

訓(xùn)練時(shí)將小鼠放入未通電的迷宮中適應(yīng)5 min，再將小鼠放入任意一個(gè)臂，另外兩支臂中一支以燈光信號表示安全區(qū)。燈亮后延時(shí)2 s自動接通40 V電流，小鼠跑至安全區(qū)時(shí)讓其停留30 s，鞏固記憶。訓(xùn)練10次，記錄10次里的正確次數(shù)記為學(xué)習(xí)成績。24 h后記憶測試，小鼠直接跑至安全區(qū)為正確反應(yīng)，記錄連續(xù)10次訓(xùn)練中的正確次數(shù)和記憶潛伏期（第1次跑對所需時(shí)間）［19］。

Y迷宮法優(yōu)缺點(diǎn)：構(gòu)造簡單、操作便捷、準(zhǔn)確性較高。缺點(diǎn)是一次試驗(yàn)只能觀察1只動物，下一只動物實(shí)驗(yàn)時(shí)需對儀器進(jìn)行擦拭晾干確保無上一只動物氣味，耗時(shí)長，較難實(shí)現(xiàn)組間的完全平行。

2.3 避暗法 40 cm×12 cm×12 cm的條件反射箱是由明室和暗室及兩室之間3 cm直徑的洞口組成，箱底有等距的銅柵，暗室的銅柵可通入36 V電流。

訓(xùn)練時(shí)將小鼠頭背著洞口放入明室，適應(yīng)環(huán)境3 min后通電，通電持續(xù)5 min，小鼠進(jìn)入暗室就會遭受電擊，其正確反應(yīng)是回到明室。24 h后測試，小鼠第1次進(jìn)入暗室的時(shí)間記為潛伏期，5 min內(nèi)進(jìn)入暗室的次數(shù)為錯(cuò)誤次數(shù)，5 min內(nèi)未進(jìn)入暗室的潛伏期按 300 s計(jì)算［20］。

避暗法優(yōu)缺點(diǎn)：操作簡單易行、對記憶再現(xiàn)實(shí)驗(yàn)有較高的靈敏度。缺點(diǎn)是影響因素多，耗時(shí)長。

2.4 Morris水迷宮法 直徑120 cm、高50 cm的圓形水池，四周有用于辨別方向的標(biāo)志。水池分為4個(gè)象限，直徑為9 cm的可移動平臺置于第2象限，且位置固定，平臺位于水下0.5 cm處。水池上方安裝有視頻采集分析系統(tǒng)，可以自動記錄分析動物游泳軌跡。

（1）定位航行實(shí)驗(yàn)：歷時(shí)4 d，第1～2天平臺可見（平臺上方插有高5 cm的黑色旗子用于動物辨認(rèn)），第3～4天平臺不可見（撤掉旗子）。每天的同一時(shí)間，小鼠依次從第一象限開始，面朝池壁放入水中，記錄從入水到上臺的時(shí)間，即為逃避潛伏期。若小鼠90 s內(nèi)沒有找到平臺，則實(shí)驗(yàn)自動結(jié)束，此時(shí)記錄逃避潛伏期為90 s，并引導(dǎo)小鼠置于平臺30 s。休息10 min后換入水點(diǎn)，依次訓(xùn)練4個(gè)象限。

（2）空間探索實(shí)驗(yàn)：訓(xùn)練4 d，第5天撤去平臺開始實(shí)驗(yàn)，歷時(shí)1 d。小鼠從距離原平臺最遠(yuǎn)的象限開始，面朝池壁放入水中，記錄入水后90 s自由航行的軌跡，統(tǒng)計(jì)小鼠穿越原平臺所在位置次數(shù)，目標(biāo)象限（原平臺所在象限）的停留時(shí)間百分比以及穿越目標(biāo)象限的次數(shù)［21］。

水迷宮法優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)是原理簡單易懂，構(gòu)造簡單、檢測靈敏，對實(shí)驗(yàn)動物損傷小，不易受氣味影響，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較豐富能更好地完整地體現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶差異。缺點(diǎn)是對實(shí)驗(yàn)條件要求較高，水溫、平臺高度、聲音、實(shí)驗(yàn)時(shí)間、入水的朝向、高度都應(yīng)該盡量一致；單次定位航行訓(xùn)練時(shí)間的設(shè)定有較大的經(jīng)驗(yàn)性，個(gè)體差異較大。

3 小結(jié)與展望

迄今為止，猴、嚙齒類動物、蠕蟲和果蠅等均可以用來構(gòu)建學(xué)習(xí)記憶障礙模型，即使小鼠在表觀上并不能表現(xiàn)出斑塊沉積，但一些特殊的造模方法仍然能使小鼠腦內(nèi)特定區(qū)域形成斑塊沉積和神經(jīng)元纏結(jié)，同時(shí)小鼠在實(shí)驗(yàn)可行性及經(jīng)濟(jì)方面的優(yōu)勢促使小鼠成為最常用的學(xué)習(xí)記憶障礙模型。除了文中提及的國內(nèi)常用的東莨菪堿、亞硝酸鈉、乙醇、D-半乳糖、β淀粉樣沉積、腦缺血誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶障礙模型外，還可以用一些其他神經(jīng)毒性物質(zhì)來構(gòu)建學(xué)習(xí)記憶障礙模型，如：6-羥基多巴胺、1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫嘧啶（MPTP）、重金屬等毒性物質(zhì)［22］。然而這些模型只是構(gòu)建了一種疾病狀態(tài)并沒有模擬疾病的發(fā)生發(fā)展過程，因此研究者通過構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠來構(gòu)建自發(fā)的學(xué)習(xí)記憶障礙模型，例如APP／PS1轉(zhuǎn)基因小鼠與AD患者腦內(nèi)均出現(xiàn)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動異常興奮及海馬代償性產(chǎn)生的抑制［23］，這就表明APP／PS1轉(zhuǎn)基因小鼠與AD患者具有高度相似的神經(jīng)活動，為后面的機(jī)制研究和藥物研發(fā)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，然而實(shí)驗(yàn)條件及高昂的花費(fèi)限制了這一模型的廣泛應(yīng)用。

構(gòu)建好學(xué)習(xí)記憶障礙模型后，并不能直觀的從動物的表型上判斷出來，只能通過條件反射來區(qū)別。文中提及的跳臺法、避暗法、Y迷宮法都是基于被動逃避條件反射為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)方法，它們具有操作簡便、指標(biāo)明確、易于觀察等優(yōu)點(diǎn)，然而在這些實(shí)驗(yàn)過程中有較多的主客觀因素會對其造成影響，這就導(dǎo)致重復(fù)性差，而且即使模型成功、藥效良好，它們的組間差異也較小。這就要求在實(shí)驗(yàn)過程中，應(yīng)盡量保證外界環(huán)境及實(shí)驗(yàn)人員的穩(wěn)定，目前行為學(xué)檢測方法仍需進(jìn)一步的完善。

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