鹽酸芬戈莫德含量測定方法研究

■陳 冰彭 誠路海濱

（1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林省吉林市 132101；2.吉林大學(xué)，吉林長春130021）

芬戈莫德（fingolimod）是從冬蟲夏草中提取的，將其中的有效成分多球殼菌素的手性中心去除，修飾側(cè)鏈后合成的一種新型免疫抑制劑。近年來，人們對芬戈莫德的研究越來越多，由于其毒性小，作用機(jī)理獨特，可用于飼料添加劑、建立動物模型等方面，具有廣闊的研究價值和應(yīng)用前景。但該藥物的質(zhì)量分析方法標(biāo)準(zhǔn)還尚不完善，因此本文對自制合成的鹽酸芬戈莫德原料藥建立了HPLC法進(jìn)行質(zhì)量檢查的方法。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

鹽酸芬戈莫德對照品（含量為99.7%，中國生物制品檢定所）；鹽酸芬戈莫德供試品，吉林大學(xué)藥學(xué)院實驗室自制；甲醇、乙腈為色譜級，其它試劑均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

安捷倫1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；VWD型及DAD型檢測器(美國安捷倫公司)；KQ-400型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；CPA-225D型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]。

2 鹽酸芬戈莫德含量測定分析方法建立

2.1 溶液的配制

2.1.1 對照品溶液的配制

取鹽酸芬戈莫德的對照品約10 mg，精密稱定，置100 ml量瓶中，加流動相適量，振搖、超聲使其溶解，用流動相稀釋至刻度，微孔濾膜濾過，即得。

2.1.2 供試品溶液的配制

取鹽酸芬戈莫德供試品適量，精密稱定，按對照品溶液濃度配制成供試品溶液，加適量流動相振搖、超聲使其溶解，微孔濾膜濾過，即得。

2.2 色譜條件確定

2.2.1 最大吸收波長的確定

取鹽酸芬戈莫德對照品溶液0.5 ml，置5 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。按紫外-可見分光光度法以相應(yīng)試劑為空白，進(jìn)入DAD型檢測器，在200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果見圖1。

圖1 鹽酸芬戈莫德對照品光譜掃描三維圖

結(jié)果表明，對照品溶液在215 nm處有最大吸收峰，綜合掃描結(jié)果，確定波長為215 nm。

2.2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent C18-SB柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測器：紫外檢測器；流動相：高氯酸鈉溶液（取高氯酸鈉14 g，定容至1 000 ml，加入適量高氯酸使其pH值為2.8）∶甲醇∶乙腈=93∶3∶100；柱溫：25 ℃；流速：1.5 ml/min；檢測波長：215 nm。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗

在本色譜條件下，供試品溶液中鹽酸芬戈莫德得到較好的分離，其色譜峰的保留時間與對照品一致，并且理論塔板數(shù)為2 000以上。結(jié)果見圖2～圖4。

圖2 鹽酸芬戈莫德對照品色譜圖

圖3 鹽酸芬戈莫德供試品色譜圖

圖4 空白溶劑色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 檢測限與定量限

取鹽酸芬戈莫德對照品適量，用流動相稀釋，以信噪比S/N=3進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10 μl，計算檢測限為1 ng，以信噪比S/N=10進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10 μl，計算定量限2 ng。見圖5～圖6。

圖5 檢測限檢測色譜圖

圖6 定量限檢測色譜圖

2.3.2 專屬性考察

為考察鹽酸芬戈莫德在生產(chǎn)工藝及貯藏過程中可能的降解產(chǎn)物和色譜條件的選擇性，采用酸、堿、氧化、高溫等手段對本品進(jìn)行破壞性處理。鹽酸芬戈莫德在酸破壞、堿破壞和高溫破壞條件下產(chǎn)生一定降解，在氧化條件下較為穩(wěn)定，所產(chǎn)生的降解產(chǎn)物在選定色譜條件下均可與主峰達(dá)到基線分離，方法專屬性良好。

2.3.3 線性關(guān)系考察

取鹽酸芬戈莫德對照品適量，配成1 mg/ml的貯存溶液，然后分別配制不同濃度為0.055 0、0.082 5、0.110 0、0.137 5、0.165 0 mg/ml的鹽酸芬戈莫德對照品溶液5份，加流動相定容至刻度，搖勻，過濾，取濾液，作為不同濃度對照品溶液；分別將不同濃度對照品溶液進(jìn)樣10 μl測定，記錄峰面積，以對照品峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，對照品濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求得回歸方程。結(jié)果見圖7。

圖7 鹽酸芬戈莫德標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖7顯示，鹽酸芬戈莫德在0.055 0～0.165 0 mg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=158 490 160X-51 837.4，r2=0.999 8。

2.3.4 精密度試驗

取同一濃度對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量為10 μl，依法進(jìn)行測定，記錄峰面積，計算RSD值為0.11%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗

取同一批樣品6份，按“2.1.2”項下制備供試品溶液，依法進(jìn)行含量測定，記錄峰面積，計算RSD為0.09%，表明含量測定重復(fù)性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗

在本試驗條件下，取供試品溶液分別在室溫放置0、2、4、6、8、12 h，依法進(jìn)行含量測定，記錄峰面積，供試品溶液在0～12 h內(nèi)的測定結(jié)果的RSD為0.13%。說明在此時間范圍內(nèi)測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.3.7 回收率試驗

取鹽酸芬戈莫德9份，每3份分別按照標(biāo)示量的80%、100%、120%比例精密加入鹽酸芬戈莫德對照品，按照“2.1.2”項下制備供試品溶液，依法進(jìn)行含量測定。加入量、測得量及回收率試驗結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果

結(jié)果表明，加樣回收率的RSD值為1.37%，結(jié)果符合要求，方法的準(zhǔn)確度好、可行。

2.3.8 耐用性試驗

此項分別考察了流速相對值變化±20%、柱溫變化±5℃、流動相pH值變化±0.2、流動相比例變化±5%進(jìn)行測定時，儀器色譜行為的變化，每個條件下各測試兩次。要求是主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰與雜質(zhì)峰必須達(dá)到基線分離。測定結(jié)果見表2。

表2 耐用性試驗結(jié)果

由結(jié)果可以看出，樣品在柱溫、流速、流動相pH值、流動相配比變化等條件改變下，主峰與雜質(zhì)峰達(dá)到基線分離，分離度合格，拖尾因子均沒有大于2.0，理論塔板數(shù)不低于2 000，均符合規(guī)定，從以上數(shù)據(jù)表明本方法的耐用性良好。

2.4 樣品質(zhì)量檢查

按上述所建立的含量測定方法，對三批自制鹽酸芬戈莫德原料進(jìn)行質(zhì)量檢查，測定結(jié)果見表3。

表3 三批樣品含量測定結(jié)果

由測定結(jié)果表明，三批自制鹽酸芬戈莫德與對照品溶液主峰的保留時間一致，且原料藥HPLC圖譜呈單一對稱主峰，按外標(biāo)法以對稱峰面積計算原料藥的鹽酸芬戈莫德含量均在99.0%以上，符合鹽酸芬戈莫德含量在98.5%～101.5%的要求。

3 結(jié)論

本文對所建立含量測定的分析手段進(jìn)行方法學(xué)驗證考察，很有實際參考價值。鹽酸芬戈莫德對照品溶液的DAD檢測結(jié)果顯示該物質(zhì)在215 nm有最大吸收，并確定了色譜條件。在此條件下，供試品溶液中鹽酸芬戈莫德得到較好的分離，其色譜峰的保留時間與對照品一致，并且理論塔板數(shù)為2 000以上；方法專屬性良好；鹽酸芬戈莫德在0.055 0～0.165 0 mg/ml范圍內(nèi)濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，精密度RSD為0.11%，重復(fù)性RSD為0.09%，穩(wěn)定性RSD為0.13%，加樣回收率RSD為1.37%，表明此方法可行，樣品耐受性良好。采用所建立的質(zhì)量控制分析方法對三批自制樣品進(jìn)行質(zhì)量檢查，結(jié)果含量均在98.5%～101.5%，符合要求。結(jié)果證明所建立的方法完全可以用于本品的質(zhì)量控制。