使用一種新底物優(yōu)化角蛋白酶活性檢測方法的研究

■張雅潔 徐 麗 程 瑛 鄧曉旭 陳雪姣 周 櫻

（武漢新華揚生物股份有限公司，湖北武漢430074）

角蛋白組成結(jié)構(gòu)主要有兩大類，即α-角蛋白與β-角蛋白。這兩種角蛋白結(jié)構(gòu)中含有大量的二硫鍵、氫鍵等，并形成復(fù)雜的三維超螺旋結(jié)構(gòu)[1]，這使角蛋白的結(jié)構(gòu)復(fù)雜而致密，使之具有非常穩(wěn)定的性質(zhì)，非常難被一般常見的蛋白酶破壞。但角蛋白營養(yǎng)豐富，在羽毛中的粗蛋白質(zhì)含量在80%以上，各種氨基酸含量占總量的70%以上，并且含有多種動物所需要的必需氨基酸[2]。角蛋白酶(Keratinase)是一種可以特異性降解角蛋白的酶類，由細菌、放線菌和真菌等多種微生物產(chǎn)生[3]，能夠?qū)⒂鹈入y分解的角蛋白廢棄物轉(zhuǎn)化為可消化蛋白。

目前國內(nèi)外仍沒有統(tǒng)一角蛋白酶活性的檢測標(biāo)準(zhǔn)，而且因角蛋白的不溶性導(dǎo)致在測定角蛋白酶活性時存在一些問題，使得不同的研究結(jié)果之間很難進行比較和交流。本試驗采用一種新的角蛋白底物，使用GB23527—2009附錄B蛋白酶活性的測定（福林法）方法來測定角蛋白酶的活性，從底物濃度、反應(yīng)時間、吸光值范圍和底物專一性等方面研究了此底物是否適用于角蛋白酶的檢測，從而優(yōu)化傳統(tǒng)檢測角蛋白酶的方法，增加此方法的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

除特殊說明外，所用的試劑均為分析純，水均為符合GB/T 6682中規(guī)定的二級水。

1.1 試劑與設(shè)備

試驗用角蛋白酶、蛋白酶、木聚糖酶和脂肪酶均來源于武漢新華揚生物股份有限公司。

水解角蛋白K0043（TCI公司），硼酸鈉（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），三氯乙酸（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），福林試劑（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），酪氨酸（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司），氫氧化鈉（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司），WH-2微型旋渦混合儀（上海瀘西分析儀器有限公司），移液器（Thermo公司），THZ-82恒溫振蕩器（國華電器有限公司）,UV-2800紫外可見分光光度計（上海尤尼柯儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

因為角蛋白酶仍屬于蛋白酶類，所以本實驗參考《GB23527—2009附錄B蛋白酶活性的測定(福林法)》。根據(jù)已經(jīng)研究得出的結(jié)果可知角蛋白酶的最適pH值偏堿性[4-6]，且為了統(tǒng)一蛋白酶和角蛋白酶檢測方法，此次試驗不對反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH值進行研究，直接使用堿性蛋白酶的檢測條件。

將角蛋白酶酶活定義為：1 g固體酶粉（或1 ml液體酶），在一定溫度和pH值條件下，1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸，即為1個酶活力單位，以U/g（U/ml）表示。

具體試驗方法如下：將水解角蛋白用硼酸緩沖液（pH值10.5）配制成底物溶液。取1 ml稀釋至適當(dāng)濃度的酶稀釋液，加入1 ml水解角蛋白底物，于40℃水浴反應(yīng)后以2 ml三氯乙酸溶液終止，空白先加入三氯乙酸溶液，再加入底物。反應(yīng)結(jié)束后過濾，取濾液1 ml于玻璃管中，加入5 ml 0.4 mol/l Na2CO3溶液和1 ml福林試劑，于40℃保溫20 min后，測定680 nm的吸光值。根據(jù)酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的線性回歸方程可以算出反應(yīng)液中的酪氨酸的含量，并得到角蛋白酶的活性。

1.2.1 不同底物濃度

將水解角蛋白分別配制成 0.1%、0.2%、0.4%、0.5%、1%、1.5%和2%的濃度的底物溶液。將酶液稀釋至適當(dāng)濃度后按照1.2所述試驗方法進行試驗，反應(yīng)時間為10 min。

1.2.2 不同反應(yīng)時間

將底物濃度控制在1%，相同酶濃度下分別反應(yīng)5、10、15 min和20 min，試驗方法按照1.2所述進行試驗。

1.2.3 不同吸光值范圍

將底物控制在1%，反應(yīng)時間為10 min，分別將初始酶液稀釋至100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍和1 000倍進行試驗并根據(jù)計算公式計算酶活。

1.2.4 不同酶種分別與底物反應(yīng)

為驗證底物的專一性，分別稱取酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木聚糖酶和脂肪酶，采用GB23527—2009附錄B蛋白酶活性測定（福林法）堿性蛋白酶的條件提取后，按照1.2所述方法進行試驗，底物濃度為1%，反應(yīng)時間為10 min。

2 試驗結(jié)果

根據(jù)GB23527—2009，繪制酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)圖1可得到酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=0.010 0x+0.004 1，R2=0.999 6，可得出K值為99.5，符合國標(biāo)要求。

2.1 不同底物濃度對試驗結(jié)果的影響

試驗中稱取角蛋白酶約1 g，用緩沖液稀釋200倍。此酶濃度下的角蛋白酶與不同濃度的底物溶液進行反應(yīng)的試驗結(jié)果見表1。

以底物濃度（%）為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)速度（μg/min）為縱坐標(biāo)繪制平滑曲線得圖2。

根據(jù)圖2可以觀察出，當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?.5%以上時，反應(yīng)速度的增長逐漸趨于平緩，說明繼續(xù)增大底物濃度并不能繼續(xù)提高反應(yīng)速率，也就是酶活性也隨之趨于平緩。設(shè)底物濃度為S，反應(yīng)速度為V，繼續(xù)采用雙倒數(shù)作圖，即以1/S為橫坐標(biāo)，以1/V為縱坐標(biāo)做回歸曲線，得到圖3。

得到回歸方程為y=0.132 3x+0.054 2，R2=0.996 8，可得到Km值為2.44%。按照理論，反應(yīng)的底物濃度S應(yīng)為Km值的5倍以上，但是根據(jù)上述試驗空白的吸光值可以看出，當(dāng)?shù)孜餄舛仍礁邥r，空白的吸光值也就越大，底物濃度為1%時的空白吸光值已經(jīng)接近0.5，底物濃度為1.5%時的空白吸光值接近0.6，底物濃度為2%時的空白吸光值已經(jīng)接近0.7。當(dāng)S=5 Km時，即底物濃度約為12.2%，此時的空白吸光值必定大于1，已經(jīng)超過分光光度計的有效檢測范圍。所以根據(jù)圖2及表1中的數(shù)據(jù)，將底物濃度設(shè)置為1%。

表1 不同底物濃度時的反應(yīng)速度和酶活

圖2 底物濃度-反應(yīng)速度曲線圖

圖3 1/S-1/V曲線

2.2 不同反應(yīng)時間對試驗結(jié)果的影響

將初始酶液稀釋至600倍、700倍和800倍，此三種酶濃度分別反應(yīng)5、10、15 min和20 min后，計算出不同酶濃度下和不同反應(yīng)時間時的反應(yīng)速度，以反應(yīng)時間為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)速度為縱坐標(biāo)，繪制不同酶濃度下的反應(yīng)速度曲線，見圖4。

圖4 不同酶濃度的反應(yīng)速度曲線

根據(jù)圖4可以看出，3種不同的酶濃度下，反應(yīng)時間從5 min到10 min時，反應(yīng)速度均迅速下降，反應(yīng)時間在10、15 min和20 min時，反應(yīng)速度的變化并不是很大，趨于平緩。這說明反應(yīng)0～5 min時，酶解反應(yīng)仍在進行中；10 min以后，酶解反應(yīng)的速度基本趨于平緩，說明酶解反應(yīng)基本已經(jīng)保持平衡，進行比較徹底，由此可以認為10 min是該試驗比較合適的反應(yīng)時間。

2.3 不同吸光值范圍對試驗結(jié)果的影響

根據(jù)1.2.3所述條件進行試驗，得到的結(jié)果見表2。

根據(jù)表2的結(jié)果可以看出，當(dāng)酶濃度減小時，相應(yīng)的吸光值也在隨之降低，說明酶濃度與吸光值之間存在正比例關(guān)系，而且不同酶濃度下的平行值均較好。根據(jù)吸光值較好的范圍，對數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)進行分析，結(jié)果見表3。

表2 不同酶濃度下角蛋白酶的活性

表3 不同吸光值范圍的結(jié)果之間標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)

一般酶活性檢測中，吸光值有效范圍基本在0.2～0.5之間。在此范圍內(nèi)對不同區(qū)間的吸光值范圍的結(jié)果進行分析，可以看出這段吸光值區(qū)間內(nèi)的結(jié)果比較集中，變異系數(shù)很小，得到的結(jié)果比較集中，說明控制吸光值的范圍，不同酶濃度所得到的結(jié)果都能較科學(xué)的表現(xiàn)出酶活性。此試驗中認為變異系數(shù)在7%以下的吸光值區(qū)間都可以算作真實有效的，所以認為吸光值在0.2～0.45之間比較合適。

2.4 不同酶種對試驗結(jié)果的影響

分別與不同酶種反應(yīng)后得到的試驗結(jié)果見表4。

根據(jù)表4的結(jié)果可以看出，中性蛋白酶和堿性蛋白酶按照此方法可以檢測出部分角蛋白酶的活性，可能是因為角蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶均屬于蛋白酶類，中性蛋白酶和堿性蛋白酶在生產(chǎn)過程中發(fā)酵條件與角蛋白酶相似，所以在分離提純時也會將同屬蛋白酶類的角蛋白酶包含進去，所以中性蛋白酶和堿性蛋白酶能夠檢測出角蛋白酶的活性。而酸性蛋白酶、木聚糖酶和脂肪酶測出的吸光值都非常低，可以認為是誤差影響的吸光值，當(dāng)吸光值低于0.003時，還會計算出負值。這說明了此種水解角蛋白底物的專一性比較好，角蛋白酶可特異水解此種底物。

表4 不同酶種與水解角蛋白反應(yīng)酶活

3 結(jié)論

本試驗從底物濃度、反應(yīng)時間、吸光值有效范圍和底物專一性這四個方面科學(xué)的研究了液體角蛋白在檢測過程中的適用性和可行性，優(yōu)化了傳統(tǒng)檢測角蛋白酶活性的方法。研究認為采用水解角蛋白作為底物時，底物濃度1%、反應(yīng)時間10 min、凈吸光值有效范圍0.2～0.45，在滿足上述條件時測定出來的角蛋白酶活性可以較準(zhǔn)確的反映出角蛋白酶的真實活性。優(yōu)化后的方法在一定程度上可以更科學(xué)的衡量發(fā)酵水平，改進生產(chǎn)技術(shù)提供一定幫助。