植物乳桿菌對尼羅羅非魚的腸道黏膜免疫調(diào)節(jié)及生長性能的影響

■劉長軍

(象山縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，浙江象山315700)

益生菌是一類能在腸道內(nèi)定植，維護腸道菌群平衡，并刺激腸黏膜免疫組織，對腸道黏膜免疫有重要的影響的有益微生物群落。近些年來已有很多學(xué)者研究表明，益生菌可以影響動物的免疫功能，增加腸道黏膜對外界的抵抗力，增強動物機體的抗病性[1-3]。然而，不同菌株的特性、穩(wěn)定性及作用機制各不相同，尚待進一步挖掘與研究。隨著水產(chǎn)動物飼料中抗生素等化學(xué)藥物的應(yīng)用帶來的負面作用日益突出，如何有效地提高水產(chǎn)動物的免疫力和對疾病的抵抗力成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵和研發(fā)熱點。由于具有使用安全和方便等優(yōu)點，益生菌被逐漸應(yīng)用于魚類、甲殼類等水產(chǎn)動物飼料中，如酵母菌、乳酸菌等復(fù)合益生菌應(yīng)用于羅非魚養(yǎng)殖中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)羅非魚的生長及成活率都有所提高，并且可以顯著提高抗氧化水平和腸道蛋白酶活性[4-5]。

尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）引種于非洲，因其生長快、體型大、肌間刺少、口感鮮美，深受消費者喜愛。在養(yǎng)殖中，國內(nèi)外關(guān)于羅非魚細菌性疾病的報道較多，主要有無乳鏈球菌（Streptococcusagalaciate）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）等，其中嗜水氣單胞菌可引起羅非魚體色發(fā)黑、肝臟充血、腹腔積水，死亡率很高[6]。有最新研究表明，商業(yè)化益生菌制劑AquaStar Growout飼喂羅非魚可提高生長性能，并且調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫和提高抗細菌感染能力[7]。本研究基于前期分離的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)08.923，研究其對尼羅羅非魚腸道黏膜免疫調(diào)節(jié)的作用，以及對生長性能和抗病力的影響。

1 材料與方法

1.1 細菌菌株和培養(yǎng)

植物乳桿菌08.923（L.plantarum08.923）分離于發(fā)酵乳，由浙江省重點實驗室惠贈；嗜水氣單胞菌NJ-1（NJ-1）由上海海洋大學(xué)惠贈。將分離保存的植物乳桿菌 08.923接種于MRS（de Man,Rogosa,Sharpe）肉湯培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)48 h。嗜水氣單胞菌NJ-1用LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基培養(yǎng)，37 ℃搖床培養(yǎng)12 h，300 r/min。將菌液離心（3 500×g，10 min，4℃），棄上清。用無菌PBS緩沖液漂洗三次后加入適量的PBS重懸，參照嗜水氣單胞菌的標準曲線計算懸濁液中嗜水氣單胞菌的濃度[8]。

1.2 尼羅羅非魚的飼養(yǎng)及飼料的制備

健康尼羅羅非魚購自浙江武義水產(chǎn)良種場，為尼羅羅非魚吉福品系，初始體重（18.0±2.5）g/尾。基礎(chǔ)飼料參考《羅非魚配合飼料》（SC/T 1025—2004），每日上午和下午各投喂1次，飽飼量投喂。試驗采用的養(yǎng)殖設(shè)施為橢圓形玻璃缸（總體積0.4 m3，水體體積0.25 m3）。循環(huán)流水系統(tǒng)，曝氣自來水，每池進水速率大約為0.8 L/min。養(yǎng)殖試驗期間均連續(xù)充氧（除投餌期間外）。試驗期間水溫(25.0±1.0)℃，pH值7.5±0.5，溶氧≥5 mg/l，氨氮＜0.2 mg/l，余氯＜0.1 mg/l。

飼料共兩組：植物乳桿菌組和對照組。植物乳桿菌組的飼料制備：將培養(yǎng)好的L.plantarum08.923經(jīng)PBS緩沖液漂洗后重懸，參照Zhou等[8]中的標準曲線，細菌定量為107個細胞/ml PBS緩沖液，按照1 ml PBS緩沖液∶1 g基礎(chǔ)飼料的比例，在無菌培養(yǎng)皿中均勻噴灑含有L.plantarum08.923的PBS緩沖液，用脫脂牛奶作為保護劑，在每毫升PBS緩沖液加入0.01 g脫脂牛奶，配成107CFU/g飼料。對照組中只噴灑無菌PBS，20℃風(fēng)干15 h。并參照Harikrishnan等[9]的方法包裝、存放、檢測細菌存活率。

1.3 實驗動物分組

購買的尼羅羅非魚暫養(yǎng)7 d穩(wěn)定后開始實驗，實驗時間為70 d。將實驗魚隨機分為2組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)40尾。一組用于飼喂添加L.plantarum08.923的飼料，一組飼喂用PBS制備的飼料作為對照組，分別持續(xù)飼喂70 d后用嗜水氣單胞菌NJ-1進行浸浴攻毒實驗，每組10尾用低濃度（105CFU/ml）攻毒，攻毒12 h后將尼羅羅非魚沖洗三遍并移到普通飼養(yǎng)水中，在攻毒后的第1、2、3 d進行腸道取樣（n=3）用于PAS染色黏多糖及細胞因子表達的分析。每個重復(fù)剩余的30尾，用一次性注射器通過腹腔注射嗜水氣單胞菌菌液0.2 ml/尾（菌液質(zhì)量濃度為半數(shù)致死量1 000萬CFU/ml），并記錄攻毒后1、24、36、48、72 h和96 h內(nèi)魚死亡情況，計算存活率（Survival rate，SR）。

1.4 生長性能指標測定

在養(yǎng)殖實驗開始和結(jié)束時分別對尼羅羅非魚稱質(zhì)量，計算平均增重(Average weight gain，AWG)、增重率(Weight gain rate，WGR)、特定生長率（Specific growth rate，SGR）及餌料系數(shù)（Feed coefficient，F(xiàn)C）。

平均增重（AWG）=終末均重-初始均重

增重率（WGR，%）=（終末均重-初始均重）/初始均重×100

特定生長率（SGR，%/d）=（ln終末均重-ln初始均重）/實驗天數(shù)×100

餌料系數(shù)（FC）=投餌量/（終末均重-初始均重）

1.5 腸道切片PAS染色

取魚的腸道切片進水脫蠟后，放至過碘酸溶液2～5 min，用蒸餾水充分漂洗，在室溫浸于希夫試劑15 min，再置于亞硫酸鹽溶液，反復(fù)換液三次，每次2 min，此后在流動的水溶液中沖洗5 min，再用蒸餾水漂洗1 min，用Harris蘇木精復(fù)染，然后再在流動的水溶液中沖洗，再用蒸餾水漂洗，用85%乙醇和100%乙醇脫水，最后二甲苯處理后中性樹脂封片。

1.6 實時熒光定量PCR檢測

用Trizol提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行擴增，引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成（見表1）。采用實時熒光定量PCR儀（Nano，Roche），其中內(nèi)參基因為 RpL13。RT-PCR 采用 20 μl體系：2×SYBR Green Mix 10 μl，20 μM的正反引物各0.4 μl，cDNA模板2 μl，ddPCR水7.2 μl。

表1 實時熒光定量PCR引物參數(shù)

進行PCR擴增的程序為：95℃預(yù)變性15 min，95 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，72℃延伸20 s，40個循環(huán)，72℃延伸10 min。在65℃時繪制溶解曲線，72℃時檢測熒光信號。

1.7 數(shù)據(jù)處理

實驗中獲得的各組數(shù)據(jù)均采用Origin8.0和SPSS 16.0進行統(tǒng)計分析。結(jié)果均采用“平均數(shù)±標準差”表示，各組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（One-way ANOVA），比較均值使用Duncan’s極差檢驗，P＜0.05，認為存在顯著性差異；P＜0.01，認為存在極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 植物乳桿菌對尼羅羅非魚生長性能的影響(見表2)

表2 植物乳桿菌對尼羅羅非魚生長性能的影響

從表2可見，植物乳桿菌組的平均增重、增重率和特定生長率顯著高于對照組（P＜0.05），而餌料系數(shù)兩組間無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 植物乳桿菌對尼羅羅非魚腸道黏膜免疫的影響

2.2.1 植物乳桿菌對尼羅羅非魚腸道PAS顯色黏液細胞的影響（見圖1）

圖1 PAS染色反應(yīng)顯示不同組腸道分泌的中性黏多糖

用研究級倒置顯微鏡觀察PAS反應(yīng)，如圖1所示，箭頭所指紅色部分為腸絨毛游離面和杯狀細胞膨大部。由于PAS反應(yīng)能使中性黏多糖反應(yīng)為紅色，因此可以看出不同處理可以影響羅非魚杯狀細胞分泌中性黏多糖的含量。從實驗結(jié)果可以看出，與對照組相比，低濃度嗜水氣單胞菌NJ-1攻毒后腸道分泌的中性黏多糖明顯減少，而在植物乳桿菌組使杯狀細胞分泌的中性黏多糖顯著增多。

2.2.2 植物乳桿菌對抗感染腸道細胞因子表達量變化的影響（見圖2）

圖2顯示了低濃度嗜水氣單胞菌NJ-1攻毒后尼羅羅非魚腸道細胞因子的變化。在對照組和植物乳桿菌組中，四種細胞因子的相對表達量在攻毒后趨勢不同。在攻毒后第1 d，飼喂L.plantarum08.923組的細胞因子IL-1β的相對表達量比對照組顯著提高（P＜0.001），但是隨著攻毒后時間的延長，植物乳桿菌組的尼羅表達量逐漸與對照組接近（P＜0.01），直到攻毒后第3 d兩組無顯著差異。而對于TNF-α和IL-10的相對表達量，在攻毒后的第1 d，飼喂L.plantarum 08.923比對照組都顯著升高（P＜0.01），但是在攻毒后的第3 d，TNF-α和IL-10的相對表達明顯回落，但是植物乳桿菌組的IL-10還是處于一種較高的相對表達水平狀態(tài)（P＜0.05）。在攻毒后第1 d和第2 d，兩組細胞因子NFκB的相對表達量均升高，且兩組間差異不明顯；但在攻毒后的第3 d，對照組NFκB的相對表達量急劇回落，而植物乳桿菌組仍保持較高水平，兩組間差異顯著（P＜0.01）。

2.3 植物乳桿菌對尼羅羅非魚抗病性的影響

在尼羅羅非魚的飼料中添加植物乳桿菌后持續(xù)飼喂70 d，再用嗜水氣單胞菌NJ-1腹腔注射攻毒，得到對照組與L.plantarum08.923處理組累積死亡率的變化如圖3所示。對照組96 h累積死亡率為98.89%，植物乳桿菌組與對照組相比有明顯的減少（P＜0.01），96 h累積死亡率為36.67%?？梢娞砑覮.plantarum 08.923對羅非魚的抗病性有了明顯的提升。

3 討論

本實驗探討了植物乳桿菌08.923對尼羅羅非魚的腸道黏膜免疫調(diào)節(jié)、生長性能及抗病力的影響。結(jié)果表明，植物乳桿菌組的平均增重、增重率和特定生長率顯著高于對照組，說明菌株具有提高尼羅羅非魚生長性能的作用。PAS腸道染色反應(yīng)顯示了添加植物乳桿菌08.923對尼羅羅非魚腸道中杯狀細胞分泌的中性黏多糖的覆蓋情況，發(fā)現(xiàn)飼喂菌株后能有效刺激魚腸道中中性黏多糖的分泌量的增多，從而推測其能在腸黏膜保護中起到增強化學(xué)屏障作用。

圖2 低濃度嗜水氣單胞菌NJ-1攻毒后植物乳桿菌對尼羅羅非魚體內(nèi)細胞因子相對表達量的影響

圖3 嗜水氣單胞菌NJ-1注射攻毒羅非魚的平均累積死亡率

IL-1β和TNF-α是促炎性因子，IL-10是抑炎性細胞因子，而核因子κB（NFκB）體系主要涉及機體防御反應(yīng)、組織損傷和應(yīng)激、細胞分化和調(diào)亡以及腫瘤生長抑制過程的信息傳遞[10]。實驗結(jié)果顯示，添加植物乳桿菌08.923對于細胞因子NFκB、TNF-α和IL-10的相對表達比對照組都相對較高，說明菌株對尼羅羅非魚的免疫刺激可能是通過NFκB信號通路實現(xiàn)的。抑炎性細胞因子IL-10具有限制腸上皮細胞對致病菌的免疫應(yīng)答和維持對共生細菌穩(wěn)態(tài)的作用[11]，添加植物乳桿菌組的尼羅羅非魚腸道中抑炎因子IL-10的相對表達量顯著升高，揭示了植物乳桿菌08.923可以減小機體對于致病菌引起的炎癥反應(yīng)。有研究報道，益生菌（包括混合益生菌制劑VSL#3、單一的雙歧桿菌、乳酸桿菌或乳酸乳球菌）能夠促進單核/巨噬細胞或者樹突細胞產(chǎn)生IL-10[12-14]。我們進行的嗜水氣單胞菌攻毒實驗，發(fā)現(xiàn)添加L.plantarum08.923后尼羅羅非魚的累積死亡率顯著降低，可能是因為植物乳桿菌08.923增強了腸道黏膜屏障和提高細胞免疫因子的調(diào)控分泌，使得其抗病力提升。

綜上所述，植物乳桿菌08.923對尼羅羅非魚有顯著的黏膜免疫調(diào)節(jié)能力，在一定程度上能抑制炎癥反應(yīng)，增強機體的免疫應(yīng)答，因而能顯著提高生長性能及抗病力。植物乳桿菌08.923可作為預(yù)防水產(chǎn)動物疾病和促進生長的理想選擇，本研究結(jié)果也為闡明益生菌先天性免疫調(diào)節(jié)作用機理提供證據(jù)。