高效液相色譜-熒光檢測(cè)法與抗生素微生物檢定法測(cè)定那西肽預(yù)混劑含量的比較研究

■林仙軍 周芷錦 王 彬

（浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，浙江杭州311101）

那西肽（Nosiheptide）是一種含硫多肽類畜禽專用抗生素[1]，能夠抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成，低濃度抑菌，高濃度殺菌，對(duì)葡萄球菌、梭狀芽孢桿菌等革蘭氏陽性菌有較強(qiáng)的抗菌活性[2]。那西肽能促進(jìn)豬[3]、雞生長(zhǎng)[4]，提高飼料轉(zhuǎn)化率，既可以作為飼料添加劑，又可作為獸藥預(yù)混劑，廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)中。那西肽預(yù)混劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2017年版（化學(xué)藥品卷）[2]，包括1 000 g∶20 g（2 000萬單位）、1 000 g∶40 g（4 000萬單位）和1 000 g∶80 g（8 000萬單位）等6個(gè)規(guī)格，該標(biāo)準(zhǔn)采用抗生素微生物檢定法[5]測(cè)定那西肽的含量，結(jié)果較準(zhǔn)確、可靠，是傳統(tǒng)的測(cè)定方法。但由于抗生素微生物檢定法靈敏度較差[6]，檢測(cè)周期長(zhǎng)，不適宜批量檢測(cè)，對(duì)于偏離估計(jì)效價(jià)10%以上的樣品需重新估價(jià)檢測(cè)，對(duì)于有干擾或極低含量的樣品則存在誤差較大或無法測(cè)定等問題。

目前，那西肽的檢測(cè)方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7]、高效液相色譜紫外檢測(cè)法[8-9]、高效液相色譜熒光檢測(cè)法[10-12]和微生物檢定法[2]等。農(nóng)業(yè)部公告第2382號(hào)[13]發(fā)布的那西肽發(fā)酵液干燥品配制的那西肽預(yù)混劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，采用高效液相色譜紫外檢測(cè)法測(cè)定那西肽組分，采用抗生素微生物檢定法測(cè)定含量。

為了準(zhǔn)確測(cè)定那西肽預(yù)混劑中那西肽的含量，參考飼料中那西肽的檢測(cè)方法[11]，研究了高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定那西肽預(yù)混劑含量的方法，方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，對(duì)建立的方法與抗生素微生物檢定法進(jìn)行比較，以期為獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供新的選擇。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

那西肽對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)為K0431212，按C51H43N13O12S6計(jì)，含量88.6%，每1 mg相當(dāng)于928那西肽單位；乙腈、甲醇和N,N-二甲基甲酰胺等為色譜純；乙二胺四乙酸二鈉、硼酸鈉、硼酸、乙醇、氯化鈉、磷酸氫二鉀和氫氧化鉀等為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為milli-Q超純水。那西肽預(yù)混劑供試品（浙江匯能生物股份有限公司提供）分別為1 000 g∶20 g（2000萬單位，批號(hào)為 117102501）、1 000 g∶40 g（4000萬單位，批號(hào)為117102504）和1 000 g∶80 g（8 000萬單位，批號(hào)為117102507）；藤黃微球菌[CMCC(B)28001]；抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅱ號(hào)（pH值6.5～6.6，杭州微生物試劑有限公司提供）。

硼酸混合溶液：取0.05 mol/l硼酸鈉溶液1 000 ml，加0.2 mol/l硼酸溶液10 ml。取上述溶液-水-乙醇（1∶1∶2），混合，搖勻，即得。臨用前配制。

滅菌磷酸鹽緩沖液：取磷酸氫二鉀13.3 g與氫氧化鉀6.6 g，加水溶解成1 000 ml，濾過，在115℃滅菌30 min。

Waters 2695-2475高效液相色譜儀（配Empower 2軟件）；梅特勒-托利多（METTLER TOLEDO）XS-205電子天平（精度為0.01 mg）；上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司SL502 N電子天平（精度0.01 g）；梅特勒-托利多（METTLER TOLEDO）FE20 pH計(jì)；昆山市超聲儀器有限公司KQ-500E型超聲波清洗器。多功能微生物自動(dòng)測(cè)量分析儀（北京先驅(qū)威峰技術(shù)開發(fā)公司，ZY-3001V）；37℃恒溫培養(yǎng)箱；鋼管自動(dòng)放置器（北京先驅(qū)威峰技術(shù)開發(fā)公司，ZY-300G）；三洋MLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋；Thermo Scientific A2生物安全柜。

1.2 高效液相色譜法

取那西肽預(yù)混劑適量（約相當(dāng)于那西肽10 mg），于100 ml量瓶中，加入N,N-二甲基甲酰胺稀釋，置超聲波清洗器中超聲5 min，取出，冷卻至室溫，定容；過濾，取續(xù)濾液1.00 ml置100 ml量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm尼龍濾膜，上機(jī)測(cè)定。對(duì)照品溶液同法操作。

1.2.2 液相色譜參考條件

色譜柱為Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）；熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)327 nm，發(fā)射波長(zhǎng)521 nm；柱溫為30℃；流速為1.0 ml/min；進(jìn)樣量為20 μl；流動(dòng)相為0.02%磷酸溶液（A）和乙腈（B），梯度洗脫程序見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.3 抗生素微生物檢定法

1.3.1 對(duì)照品溶液和供試品溶液的配制

依據(jù)《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2017年版那西肽預(yù)混劑抗生素微生物檢定法二劑量法配制。取那西肽預(yù)混劑適量，于100 ml量瓶中，加入硼酸混合溶液使成每1 ml中約含250單位的溶液，在37℃恒溫充分?jǐn)嚢? h，取上清液，再用滅菌磷酸鹽緩沖液-乙醇（85∶15）的溶液稀釋成濃度分別為每1 ml含2單位和0.5單位的溶液，作為供試品溶液的高、低濃度。對(duì)照品溶液同法操作。

1.3.2 培養(yǎng)基的制備與培養(yǎng)

取平底雙碟8套，放置水平臺(tái)面上，分別加入已滅菌、熱的培養(yǎng)基約20 ml，于碟底均勻攤布，待凝固，作為底層；另取已滅菌溫度降至約50℃的培養(yǎng)基適量，加入藤黃微球菌的菌懸液適量，能得清晰的抑菌圈，標(biāo)準(zhǔn)品溶液的高濃度所致的抑菌圈直徑在18～22 mm，搖勻，在每個(gè)雙碟中分別加入5 ml菌懸液，在底層均勻攤布，作為菌層；待培養(yǎng)基凝固后，在雙碟中等距離安置不銹鋼小鋼管4個(gè)，將對(duì)照品溶液與供試品溶液按順序滴加于不銹鋼小鋼管內(nèi)，用陶瓦圓蓋覆蓋，在37 ℃培養(yǎng)16～18 h。

1.4 結(jié)果

取那西肽預(yù)混劑供試品按照高效液相色譜法和抗生素微生物檢定法分別測(cè)定，每個(gè)平行測(cè)5份，結(jié)果按占標(biāo)示量的百分比表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜結(jié)果分析

按照1.2測(cè)定，對(duì)照品溶液和供試品溶液典型色譜圖見圖1～圖2，那西肽預(yù)混劑測(cè)定結(jié)果見表2。

首先，南通鵬越紡織有限公司應(yīng)在本身優(yōu)勢(shì)產(chǎn)品的基礎(chǔ)上，增加技術(shù)創(chuàng)新的財(cái)力物力和人力的投資。一定要及時(shí)突破“老客戶、老關(guān)系”維持公司生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)的觀念思路。再者，加大“專業(yè)人才”的引進(jìn)和培養(yǎng)。公司在研發(fā)新產(chǎn)品新技術(shù)的道路上，一定要能“舍得”，適時(shí)引進(jìn)優(yōu)秀的紡織人才和經(jīng)驗(yàn)豐富的人才。最后，制定健全完善的人員創(chuàng)新激勵(lì)機(jī)制。不僅對(duì)切實(shí)為公司創(chuàng)新的人才進(jìn)行物質(zhì)激勵(lì)、精神激勵(lì)，而且為創(chuàng)新人員創(chuàng)造更多的學(xué)習(xí)機(jī)會(huì)，幫助他們能在創(chuàng)新的道路上走得更快更遠(yuǎn)。更為重要的是，能創(chuàng)造生產(chǎn)出公司的“主打品牌”紡織品，增強(qiáng)公司的文化軟實(shí)力。

圖1 對(duì)照品溶液（濃度為1 μg/ml）色譜圖（A：那西肽）

圖2 那西肽預(yù)混劑供試品溶液（批號(hào)為117102501）色譜圖（A：那西肽）

2.2 微生物檢定法結(jié)果分析

用多功能微生物自動(dòng)測(cè)量分析儀測(cè)量各抑菌圈的直徑，并照生物檢定統(tǒng)計(jì)法進(jìn)行可信限率檢驗(yàn)與效價(jià)計(jì)算，當(dāng)可信限率不大于5%時(shí)，檢測(cè)結(jié)果有效，測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 HPLC法和抗生素微生物檢定法測(cè)定那西肽預(yù)混劑含量結(jié)果比較（占標(biāo)示量百分比平均值，n=5，%）

2.3 結(jié)果比較

HPLC法和抗生素微生物檢定法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較，HPLC法每批5次測(cè)定相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在2.0%以內(nèi)，抗生素微生物檢定法可信限率均在5.0%以內(nèi)，兩種方法占標(biāo)示量百分比平均值的相對(duì)偏差在1.5%以內(nèi)，表明結(jié)果無顯著差異。

3 討論

3.1 那西肽降解因素考察

那西肽作為多肽類抗生素，其貯藏條件要求密閉、陰涼干燥。那西肽溶液在光照、高溫、堿、高濕、金屬離子和氧化等條件下易降解[11]。取那西肽標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/ml）1.0 ml,置100 ml量瓶中，進(jìn)行室溫、避光、不避光、254 nm強(qiáng)光、4℃、-20℃等保存24 h后測(cè)定。結(jié)果，24 h內(nèi)，溫度和日光照射影響較??；254 nm強(qiáng)光照射影響較大，下降了近50%。因此，在實(shí)際的實(shí)驗(yàn)操作中要避免強(qiáng)光的照射。那西肽在氫氧化鈉溶液中不穩(wěn)定，已降解完全，剩余那西肽為0；在過氧化氫溶液中約降解10%；在鹽酸溶液中穩(wěn)定，幾乎沒有降解。因此，在樣品前處理時(shí)要綜合考慮，減少或避免這些不利因素的干擾，保證樣品檢測(cè)條件的一致性和穩(wěn)定性，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確。

3.2 乙二胺四乙酸二鈉溶液的影響

實(shí)驗(yàn)參考了飼料中那西肽的測(cè)定方法，先加入0.2 mol/l乙二胺四乙酸二鈉溶液1 ml，再加入N,N-二甲基甲酰胺，導(dǎo)致對(duì)照品溶液和供試品溶液渾濁，那西肽不能全部溶解。而直接加N,N-二甲基甲酰胺，對(duì)照品溶液澄清，那西肽預(yù)混劑供試品溶液由于受輔料的影響顯渾濁。對(duì)兩種溶解方式進(jìn)行了比較，分別取溶液進(jìn)樣檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)直接加N,N-二甲基甲酰胺溶解的對(duì)照品和供試品溶液，相應(yīng)的響應(yīng)值高約3%，說明如果先加0.2 mol/l乙二胺四乙酸二鈉溶液1 ml，再加N,N-二甲基甲酰胺有可能對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響，這要看對(duì)照品和供試品溶解的程度，這種方式不可取。

3.3 流動(dòng)相的選擇

比較了磷酸鹽緩沖液、磷酸溶液和水等與乙腈組成的體系對(duì)那西肽峰色譜的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)磷酸溶液-乙腈作為流動(dòng)相，那西肽峰型最好。優(yōu)化后，最終確定流動(dòng)相為0.02%磷酸溶液/乙腈為52/48（V/V），流速為1.0 ml/min。由于那西肽預(yù)混劑基質(zhì)比較復(fù)雜，有些樣品雜質(zhì)峰較多，會(huì)對(duì)檢測(cè)造成干擾，影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性。因此，在那西肽主峰出峰后設(shè)置一個(gè)梯度洗脫程序，用高有機(jī)相沖洗色譜柱，使雜質(zhì)沖洗充分，確保雜質(zhì)不對(duì)檢測(cè)造成影響。

3.4 線性考察

取配制的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液進(jìn)樣檢測(cè)，以峰面積Y對(duì)濃度X（μg/ml）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以那西肽峰得出回歸方程為Y=6.001 6×105X-2.988 7×104，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 9，那西肽在 0.1～25.0 μg/ml的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，能夠滿足那西肽預(yù)混劑含量的測(cè)定。

3.5 兩種方法優(yōu)缺點(diǎn)分析

抗生素微生物檢定法作為抗生素檢測(cè)的傳統(tǒng)方法，通過對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液所產(chǎn)生抑菌圈直徑大小的比較分析，所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀可靠，且真實(shí)地反映了抗生素的抑菌能力[14]。但實(shí)際操作中，對(duì)人員操作技能要求較高，影響因素較多，測(cè)定用菌懸液不易保存，需定期傳代，單次實(shí)驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng)等問題[15]。而高效液相色譜法操作簡(jiǎn)單，影響因素較少、抗干擾強(qiáng)、用時(shí)短、結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

4 結(jié)論

高效液相色譜-熒光檢測(cè)法與抗生素微生物檢定法測(cè)定那西肽預(yù)混劑含量結(jié)果無顯著差異，兩種方法均可以用于那西肽預(yù)混劑的含量測(cè)定。高效液相色譜-熒光檢測(cè)法方便快捷，能夠提高檢驗(yàn)的質(zhì)量和效率。