配合飼料和血液對(duì)菲牛蛭水蛭素活性及非特異性免疫指標(biāo)的影響

■熊 偉 秦國(guó)兵 姚俊杰王 雪 唐 鑫

(貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)系貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550025)

菲牛蛭（Poecilobdella manillensis）是吸血類(lèi)水蛭的一種，俗名金邊螞蟥、馬尼拉醫(yī)蛭，隸屬環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)（Annelida）醫(yī)蛭科（Hirudinidae）牛蛭屬（Poecilobdella Whitman）。菲牛蛭具有水蛭素(hirudin)、纖維蛋白溶解酶、抗血小板聚集成分和抑菌成分等多種活性成分，水蛭素是最主要的活性組分[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，水蛭素在心腦血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、敗血休克、高血壓以及缺少抗凝血酶Ⅲ因子等疾病方面具有巨大的優(yōu)越性和廣闊的應(yīng)用前景[2-3]。由于過(guò)度的捕撈及生態(tài)環(huán)境惡化等諸多原因的影響，菲牛蛭資源急劇下降。因此，人們?cè)谔骄糠婆ｒ稳斯ゐB(yǎng)殖方法，其中用配合飼料養(yǎng)殖也是人們關(guān)注的熱點(diǎn)。

近年來(lái)，人們從菲牛蛭攝食與生長(zhǎng)[4]、養(yǎng)殖方式[5]、病害防治[6]、繁殖[7]等方面做了很多工作，菲牛蛭的人工繁殖也取得成功。但是菲牛蛭還是采用粗放式的血液投喂，而血液的不易獲得、易腐敗、易污染、質(zhì)量不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，給養(yǎng)殖戶(hù)帶來(lái)諸多不便，限制了菲牛蛭的規(guī)模化養(yǎng)殖。因此，研究菲牛蛭的人工配合飼料是急待解決的問(wèn)題。菲牛蛭以動(dòng)物性血液為食，2014年李軍等[8]報(bào)道了菲牛蛭可以攝食配合飼料。相關(guān)研究表明餌料的改變會(huì)引起抗免疫相關(guān)酶的改變[9]，同時(shí)能刺激免疫應(yīng)答，保護(hù)機(jī)體免受損傷[10]。而配合飼料養(yǎng)殖條件下，菲牛蛭免疫能力和水蛭素活性是否受到影響是值得我們探索的問(wèn)題。所以，本研究采用雞血和自制配合飼料對(duì)菲牛蛭進(jìn)行飼養(yǎng)，從水蛭素活性和非特異性免疫指標(biāo)兩個(gè)方面對(duì)配合飼料做出評(píng)價(jià)，以期為規(guī)?；B(yǎng)殖菲牛蛭提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)菲牛蛭購(gòu)買(mǎi)于貴州蛭臻寶生物科技有限公司。隨機(jī)挑選大小均勻、體格健壯且體表無(wú)病，平均體重為（2.83±0.71）g，平均體長(zhǎng)（5.33±0.54）cm的菲牛蛭幼苗。配合飼料主要成分和含量為：血球蛋白（NP-90，4%）、血漿蛋白（NP-2002，5%）、氯化鈉（2 g）、L-精氨酸（0.175 g）、維生素C(0.2 g)，加入純凈水到1 000 ml；血液采用菜市場(chǎng)收集的雞血（不加鹽、不加水），打漿機(jī)打成血漿；灌腸投喂。試驗(yàn)用水采用花溪河河水，pH值7.5～7.8，水溫20～26 ℃，溶解氧6～9 mg/l。試驗(yàn)在塑料大棚中進(jìn)行，養(yǎng)殖箱規(guī)格為35 cm×25 cm×20 cm，為防逃采用篩娟網(wǎng)密封，并在篩娟網(wǎng)上裝置拉鏈方便飼養(yǎng)及換水。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置2個(gè)組，配合飼料組和血液組，每個(gè)組3個(gè)重復(fù)。養(yǎng)殖密度為40尾/箱。試驗(yàn)組采用自制配合飼料灌入風(fēng)干豬血腸衣中投喂，對(duì)照組采用雞血打成血漿灌入風(fēng)干豬血腸衣中投喂，養(yǎng)殖周期60 d，投喂頻率為每3 d 1次，每天換水量50%，停飼1周采樣。

1.3 樣品采集

每個(gè)重復(fù)隨機(jī)抽取28尾菲水蛭，取3尾直接放入-80℃冰箱凍存，用于水蛭素活性測(cè)定。剩余25尾置于冰上解剖取腸道及嗉囊組織，取樣菲牛蛭結(jié)構(gòu)圖參照高勝濤[11]（取樣編號(hào)：配合飼料組，嗉囊記為“ss”，腸道記為“sc”；血液組，嗉囊記為“xs”，腸道記為“xc”）。樣品置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 指標(biāo)測(cè)定

組織蛋白、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、溶菌酶（LSZ）試劑盒均購(gòu)買(mǎi)于南京建成生物工程研究院。水蛭素活性測(cè)定采用《中國(guó)藥典》2010版規(guī)定的測(cè)定方法及陳華友等[12]提供的方法（數(shù)據(jù)體現(xiàn)時(shí)，在相應(yīng)標(biāo)號(hào)前增加指標(biāo)英文縮寫(xiě)，如“LSZss”代表配合飼料組嗉囊組織中溶菌酶的活力）。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所得結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。運(yùn)用LSD和Duncan's法檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。P＜0.05認(rèn)為有顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 配合飼料和血液飼養(yǎng)對(duì)飼養(yǎng)菲牛蛭水蛭素活性的影響（見(jiàn)表1）

表1 配合飼料和血液飼養(yǎng)對(duì)菲牛蛭水蛭素活性的影響（U/g）

由表1可知，血液組水蛭素活性為(76.171 9±0.390 6)U/g，配合飼料組水蛭素活性為(75.390 6±0.391 8)U/g。血液組水蛭素活性略高于配合飼料組，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上，差異性不顯著（P＞0.05）。

2.2 配合飼料和血液飼養(yǎng)對(duì)菲牛蛭免疫指標(biāo)的影響

配合飼料和血液飼養(yǎng)對(duì)菲牛蛭溶菌酶（LSZ）的影響見(jiàn)圖1。配合飼料組腸道LSZ活力顯著低于血液組（P＜0.05），LSZ活力分別為（13.119±1.321）U/mg prot.和（62.104±6.146）U/mg prot.；配合飼料組嗉囔LSZ活力稍低于血液組，差異性不顯著（P＞0.05），LSZ活力分別為（30.223±5.642）U/mg prot.和（39.962±6.014）U/mg prot.。

配合飼料和血液飼養(yǎng)對(duì)菲牛蛭堿性磷酸酶（AKP）的影響見(jiàn)圖2。配合飼料組腸道AKP活力顯著高于血液組（P＜0.05），AKP活力分別為（148.317±8.144）U/mg prot.和（18.664±1.627）U/mg prot.；配合飼料組嗉囔AKP活性稍高于血液組，差異性不顯著（P＞0.05），AKP活力分別為(14.333±1.154)U/mg prot.和(6.333±0.577)U/mg prot.。

配合飼料和血液飼養(yǎng)對(duì)菲牛蛭酸性磷酸酶（ACP）的影響見(jiàn)圖3。配合飼料組腸道ACP活力（298.478±4.212）U/mg prot.顯著高于血液組ACP活力（67.591±5.384）U/mg prot.（P＜0.05）；配合飼料組嗉囔ACP活力（25.926±0.512）U/mg prot.稍高于血液組ACP活力（17.012±1.235）U/mg prot.，差異性不顯著（P＞0.05）。

圖1 配合飼料和血液飼養(yǎng)對(duì)菲牛蛭的溶菌酶活力影響

圖2 配合飼料和血液飼養(yǎng)對(duì)菲牛蛭的堿性磷酸酶活力影響

圖3 配合飼料和血液飼養(yǎng)對(duì)菲牛蛭的酸性磷酸酶活力影響

3 討論

3.1 配合飼料和血液飼養(yǎng)對(duì)菲牛蛭水蛭素活性的影響分析

水蛭素是水蛭唾液腺分泌物中的一種蛋白質(zhì)，是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的天然凝血酶特效抑制劑，是活血化淤的通經(jīng)良藥[13]。菲牛蛭具有多種活性成分，如菲牛蛭素、纖維蛋白溶解酶、抗血小板聚集成分和抑菌成分等，而最主要的活性成分為水蛭素（菲牛蛭素）[1]。在菲牛蛭養(yǎng)殖中，水蛭素活性作為菲牛蛭養(yǎng)殖產(chǎn)品質(zhì)量的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。在貴州養(yǎng)殖條件下，本實(shí)驗(yàn)室朱忠勝[14]得出幼體菲牛蛭水蛭素活性為(73.24±3.65)U/g。本試驗(yàn)中，水蛭素活性血液組為(76.171 9±0.390 6)U/g，配合飼料組為(75.390 6±0.391 8)U/g，在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上，血液組和配合飼料組水蛭素活性無(wú)顯著差異（P＞0.05）。表明在養(yǎng)殖周期為60 d，配合飼料對(duì)菲牛蛭水蛭素活性無(wú)影響。說(shuō)明人工配合飼料可以替代自然的血液飼料。

3.2 配合飼料和血液飼養(yǎng)對(duì)菲牛蛭LSZ的影響分析

溶菌酶(LSZ)可以分解連接N-乙酰胞壁酸(NAM)和N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）殘基之間的β-1，4糖苷鍵，破壞肽聚糖支架，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁破裂、內(nèi)含物逸出而使細(xì)菌溶解死亡，是許多生物先天性免疫系統(tǒng)的重要組成成分。LSZ廣泛存在植物、無(wú)脊椎動(dòng)物和高等動(dòng)物，依賴(lài)于物種表現(xiàn)出了嚴(yán)格且特異的時(shí)空表達(dá)模式[15]。在魚(yú)類(lèi)中，溶菌酶廣泛存在于脾臟、腎臟、頭腎、皮膚、心臟、腸和血液中[16]。而關(guān)于菲牛蛭溶菌酶存在鮮有報(bào)道，本試驗(yàn)在菲牛蛭腸道及嗉囊組織中均檢測(cè)到溶菌酶活力。

菲牛蛭屬于吸血類(lèi)水蛭，一次吸血量能達(dá)到身體體積的3倍左右，半年不攝食不影響其生理功能，吸食的血液保存在嗉囊中。而血液易變質(zhì)，容易滋生腐敗細(xì)菌，但在菲牛蛭體內(nèi)能保存完好，主要是溶菌酶的作用。溶菌酶是國(guó)內(nèi)外研究較早、較多的一種酶類(lèi)生物保鮮劑，能抑制其體內(nèi)酶活性，阻止易引起水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的微生物生長(zhǎng)繁殖，延緩腐敗進(jìn)程[17]。相關(guān)研究表明塞內(nèi)加爾鰨感染發(fā)光菌后脾臟、頭腎和肝臟中溶菌酶含量增加[18]；牙鲆經(jīng)愛(ài)德華氏菌感染后溶菌酶表達(dá)量在心臟、腸和血液中顯著提高[19]。菲牛蛭攝食配合飼料后，腸道組織中配合飼料組顯著低于血液組，嗉囊組織中LSZ活力配合飼料組稍低于血液組，降低了菲牛蛭的LSZ活力。形成這一結(jié)果的可能原因是菲牛蛭本身具有的溶菌酶對(duì)攝入食物有一定的保存作用，當(dāng)血液變質(zhì)滋生腐敗細(xì)菌時(shí)，促進(jìn)溶菌酶含量上調(diào)，更能有效地殺滅有害細(xì)菌，保證食物血液的消化吸收；而配合飼料在加工上經(jīng)過(guò)高溫滅菌，不易滋生腐敗細(xì)菌，不促進(jìn)溶菌酶含量的上調(diào)，使溶菌酶含量處于一個(gè)較低水平。

3.3 配合飼料和血液飼養(yǎng)對(duì)菲牛蛭ACP和AKP的影響分析

堿性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）是兩種非特異免疫酶，參與磷酸酶基團(tuán)代謝與轉(zhuǎn)移。AKP催化磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，催化磷酸單酯的水解反應(yīng)；ACP是溶酶體的標(biāo)志酶，主要定位于溶酶體和內(nèi)膜系統(tǒng)。對(duì)外源異物的磷酸酯外表面進(jìn)行水解作用，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用[20-21]。同時(shí)，AKP和ACP與水產(chǎn)動(dòng)物機(jī)體的生長(zhǎng)密切相關(guān)，在魚(yú)體營(yíng)養(yǎng)的吸收、利用中發(fā)揮著重要的作用[22]。飼料中添加甘露聚糖酶[23]、殼聚糖[24]等對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物AKP和ACP活力有促進(jìn)作用，而環(huán)境的脅迫（pH值、鹽度、運(yùn)輸?shù)龋?huì)導(dǎo)致AKP和ACP活力下降。在菲牛蛭腸道組織中配合飼料組AKP和ACP活力顯著高于血液組，嗉囊組織中配合飼料組AKP和ACP活力稍高于血液組。從AKP和ACP活力上看，配合飼料飼養(yǎng)菲牛蛭能達(dá)到或超過(guò)血液飼養(yǎng)水平。

菲牛蛭屬于吸血類(lèi)水蛭，嗉囊的功能主要是貯藏食物，消化吸收的能力較弱；而菲牛蛭腸道是主要的消化吸收的場(chǎng)所。磷酸酶普遍存在于動(dòng)物的各組織中，如腸組織堿性磷酸酶、胎盤(pán)堿性磷酸酶和生殖細(xì)胞堿性磷酸酶等。腸組織AKP在保持腸道平衡中發(fā)揮重要作用，飼料可以影響它的活力，具有參與調(diào)節(jié)碳酸氫鹽分泌和十二指腸pH值、通過(guò)脫磷酸作用控制細(xì)菌內(nèi)毒素誘發(fā)的腸道炎癥等功能[25]。凡是物質(zhì)交換、吸收運(yùn)轉(zhuǎn)旺盛的器官中，都顯示出AKP的高活力[26]。ACP參與磷酸酯的代謝，還參與能量轉(zhuǎn)換以及信號(hào)傳導(dǎo)等重要生命活動(dòng)。本研究中血液和配合飼料情況下，腸道組織中AKP和ACP活力均顯著高于嗉囊組織（P＜0.05），可能原因?yàn)榉婆ｒ文c道的物質(zhì)交換、吸收運(yùn)轉(zhuǎn)旺盛程度高于嗉囊，導(dǎo)致菲牛蛭腸道組織中AKP和ACP活力均顯著高于嗉囊組織中AKP和ACP活力。