Aβ1?42寡聚體對小鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞D1a IL?1β表達(dá)水平的影響研究

王鼎，李曉紅，李亞惠（1.大連醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院，遼寧大連116044；.大連醫(yī)科大學(xué)附屬友誼醫(yī)院，遼寧大連116001）

阿爾茨海默?。ˋD）又稱老年性癡呆，是老年人群常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性病之一，主要臨床表現(xiàn)包括漸進(jìn)性記憶障礙、認(rèn)知功能障礙、人格改變及語言障礙等。近年來，AD發(fā)病率逐漸升高，且患者病死率隨著年齡增加逐步增高[1]。AD神經(jīng)病理學(xué)改變主要包括腦組織中存在大量的β-淀粉樣蛋白（Aβ）構(gòu)成的老年斑，以及神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)由tau蛋白過度磷酸化和聚集形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)[2]。AD發(fā)病原因及機(jī)制尚未完全明確。炎癥因子通過誘發(fā)腦組織炎性反應(yīng)，進(jìn)而誘發(fā)AD，可能是其發(fā)病機(jī)制之一[3-5]。白細(xì)胞介素（IL）-1是重要的炎癥因子，其家族包括IL-1α、IL-1β、IL-18及IL-1受體蛋白拮抗劑等，其中IL-1β與AD關(guān)系密切。IL-1β主要由神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生和釋放，通過作用于其他細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，最終引起神經(jīng)病理學(xué)改變，促進(jìn)AD發(fā)生、發(fā)展[6]。細(xì)胞外的Aβ可通過激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑導(dǎo)致一系列的炎性反應(yīng)，進(jìn)而誘發(fā)AD[7]。然而，Aβ是否可以促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放IL-1β尚未明確。小鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞D1a具有星形膠質(zhì)細(xì)胞的特征，活化后可通過分泌炎癥因子參與局部免疫反應(yīng)。因此，本研究以D1a細(xì)胞為研究對象，結(jié)合形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)方法，分析了 Aβ1～42 寡聚體（Aβ1-42）與 IL-1β的相關(guān)性，旨在確定Aβ對神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 Allegra X-30R型低溫離心機(jī)（Beckman Coulter公司，美國），Mini-ProteinⅡ型電泳儀、iMark型酶標(biāo)儀、Gel Doc 2000型凝膠圖像分析系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國），CO2培養(yǎng)箱（ThermoFisher公司，美國），TCSSP8型熒光共聚焦顯微鏡（Leica公司，德國）。

1.1.2 試劑 Aβ1-42寡聚體（Sigma公司，美國），小鼠βactin、IL-1β 抗體（Cell Signaling Technology公司，美國），Alexa Fluor?488羊抗鼠IgG抗體（Abcam公司，美國）。胎牛血清、Dulbecco′s改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）/高糖培養(yǎng)基（Invitrogen）、胰蛋白酶（Invitrogen公司，美國），二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司，美國），聚偏二氟乙烯膜、標(biāo)準(zhǔn)蛋白標(biāo)記物（New England Biolabs公司，美國），一抗剝脫液、抗熒光淬滅劑（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國上海），XAR膠片及曝光、顯影系統(tǒng)（OneXyi公司，加拿大）。二辛可寧酸（BCA）法蛋白檢測試劑（康為世紀(jì)生物科技有限公司，中國北京），電化學(xué)發(fā)光法（ECL）蛋白檢測試劑盒（Pierce公司，美國），實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測試劑盒（Omega、Promega公司，美國），霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶（S-P）超敏鼠/兔IgG檢測試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，中國福州）。D1a細(xì)胞由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組與處理 根據(jù)噻唑藍(lán)（MTT）實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定Aβ1-42寡聚體處理細(xì)胞最適濃度為0.2 μg/mL。因此，將D1a細(xì)胞分為對照組和Aβ1-42寡聚體處理組。對照組給予2 μL DMSO處理。Aβ1-42寡聚體處理組給予Aβ1-42寡聚體處理，Aβ1-42寡聚體終濃度為 0.2 μg/mL。各組細(xì)胞藥物處理時(shí)間均為24 h。采用標(biāo)準(zhǔn)6孔板進(jìn)行細(xì)胞接種、培養(yǎng)和處理，每組3孔，且處理實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 蛋白檢測 （1）蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測：以磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細(xì)胞后，刮取細(xì)胞至滅菌的離心管中，4℃、10 000r/min離心5 min，棄上清，按比例加入蛋白裂解液，冰上裂解1 h；4°C、15 000 r/min離心15 min，取上清用于蛋白檢測。以10%十二烷基環(huán)酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白檢測樣品，4℃轉(zhuǎn)膜過夜，5% 脫脂奶粉封閉，IL-1β 抗體（1∶200）4℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，ECL檢測后進(jìn)行XAR膠片曝光、顯影。洗膜重新封閉后，β-actin抗體（1∶10 000）4°C 孵育過夜，二抗室溫孵育 2 h，膠片曝光顯影。以β-actin作為蛋白檢測參照標(biāo)準(zhǔn)。（2）免疫熒光染色和激光共聚焦掃描檢測：PBS沖洗細(xì)胞，4%甲醛固定30 min，0.3%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）處理30 min，室溫下加入羊血清預(yù)孵育30 min，IL-1β抗體（1∶200）4°C 孵育過夜。pH7.4、0.01mol/L PBS沖洗后，以羊抗兔 IgG 抗體（1∶200）室溫孵育 1 h，封片，激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。另采用4，6二脒基-2-苯吲哚（DAPI）進(jìn)行細(xì)胞核染色。

1.2.3 mRNA檢測 標(biāo)準(zhǔn)方法提取處理細(xì)胞總RNA，采用qRT-PCR檢測試劑盒進(jìn)行IL-1β mRNA檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 蛋白和mRNA檢測結(jié)果 Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，Aβ1-42寡聚體處理組D1a細(xì)胞IL-1β蛋白表達(dá)水平明顯升高。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，Aβ1-42寡聚體處理組D1a細(xì)胞IL-1β mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），見圖1。

2.2 激光共聚焦檢測結(jié)果 激光共聚焦檢測結(jié)果顯示，Aβ1-42寡聚體處理組IL-1β表達(dá)水平高于對照組（P＜0.05），見圖2。

3 討 論

目前，AD發(fā)病原因及機(jī)制尚未明確，腦組織慢性持續(xù)性炎性反應(yīng)可導(dǎo)致神經(jīng)組織病理學(xué)改變，因此被認(rèn)為是誘發(fā)AD和疾病持續(xù)進(jìn)展的主要因素[8]。在多種因素的作用下，機(jī)體產(chǎn)生和釋放大量炎癥因子，誘發(fā)非特異性炎性細(xì)胞浸潤和慢性炎性反應(yīng)，進(jìn)而誘發(fā)AD。值得注意的是，炎性反應(yīng)同時(shí)可引起Aβ在腦組織中大量沉積并逐漸形成老年斑，而老年斑的沉積最終使腦組織急性損傷轉(zhuǎn)變?yōu)槁該p傷，最終導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。因此，抑制炎癥因子的產(chǎn)生和釋放、拮抗Aβ參與炎性反應(yīng)對AD的防治十分重要。

圖1 Western blot與qRT-PCR檢測結(jié)果

圖2 激光共聚焦檢測結(jié)果

存在于腦組織細(xì)胞外的Aβ是腦內(nèi)淀粉樣蛋白前體蛋白（APP）在β-和γ-分泌酶的裂解作用下產(chǎn)生的肽段，通常以單體、二聚體、低聚物和纖維狀等多種形式存在，其中纖維狀A(yù)β是主要的神經(jīng)毒性致病物質(zhì)。纖維狀A(yù)β大量沉積是AD發(fā)病的根本原因[9]。然而，也有研究表明，可溶性Aβ寡聚體也具有較強(qiáng)的神經(jīng)毒性作用[10-11]。

在早期AD患者及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物腦內(nèi)，Aβ老年斑沉積可刺激神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化并立即和Aβ結(jié)合，進(jìn)而降解、清除Aβ老年斑[12]。然而，隨著AD病情不斷進(jìn)展，在致炎因素的長期作用下，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1、腫瘤壞死因子（TNF）-α等炎癥因子。此外，星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞在細(xì)胞間炎性反應(yīng)信號傳遞過程中相互影響，小膠質(zhì)細(xì)胞在吞噬、清除Aβ老年斑及釋放炎癥因子的同時(shí)，可以激活星型膠質(zhì)細(xì)胞，活化后的星型膠質(zhì)細(xì)胞參與清除Aβ，并同時(shí)通過分泌炎癥因子抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活性[13]。在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌的炎癥因子中，對IL-1的研究較多，已證實(shí)在AD患者受損的大腦皮層中，IL-1表達(dá)水平顯著升高，而且Aβ老年斑周圍活化的小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1表達(dá)水平也升高[14]。IL-1β作為IL-1主要的亞基之一，可通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）-p38信號通路，上調(diào)β-淀粉樣蛋白裂解酶1（BACE1）表達(dá)水平，進(jìn)而加速APP的裂解和促進(jìn)Aβ沉積[15-16]。IL-1β還可通過活化膠質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生和釋放，產(chǎn)生神經(jīng)毒性；通過促進(jìn)tau蛋白的磷酸化，通過MAPK-p38信號通路介導(dǎo)神經(jīng)纖維纏結(jié)[17]。

綜上所述，炎性反應(yīng)在AD發(fā)生、發(fā)展過程中有著至關(guān)重要的作用。Aβ不僅直接介導(dǎo)炎性反應(yīng)，其持續(xù)存在還可活化神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，釋放更多的細(xì)胞因子參與炎性反應(yīng)，使AD病理學(xué)改變處于惡性循環(huán)之中，最后導(dǎo)致AD的發(fā)生和發(fā)展。本研究以體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)Aβ1-42寡聚體可上調(diào)膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β表達(dá)水平，驗(yàn)證了Aβ1-42寡聚體與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β表達(dá)水平二者間的相關(guān)性，為進(jìn)一步探索Aβ和炎性反應(yīng)在AD發(fā)生、發(fā)展機(jī)制中的作用奠定了一定的基礎(chǔ)。