梅花鹿BST-2真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和表達(dá)

邊 帥,趙 月,白雪媛,王思明,趙大慶,王佳雯

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 吉林省人參科學(xué)研究院,吉林 長(zhǎng)春 130117）

BST-2是一個(gè)干擾素誘導(dǎo)蛋白,在受感染細(xì)胞中能夠抑制病毒粒子的釋放[1]。其抗病毒譜非常廣泛,包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、絲狀病毒、彈狀病毒、甲病毒、黃病毒、HBV以及甲型流感病毒[2-12]。同時(shí),BST-2在病毒敏感性以及胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)方面也起到了重要的作用[13]。此外,多種病毒蛋白能夠拮抗BST-2的抗病毒功能,例如HIV-1 Vpu蛋白,SIV Nef蛋白,甲型流感病毒M2蛋白等等[2,11,14]。

BST-2是一種II型單次跨膜蛋白,在不同的細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)不同[1]。其抗病毒功能是基于其獨(dú)特的膜拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu),包括一個(gè)胞外較短的N端,一個(gè)胞內(nèi)段和一個(gè)GPI錨定區(qū)[15-16]。在N端具有一個(gè)進(jìn)化保守的YxY區(qū)域,能夠介導(dǎo)NF-κB活性[17]。胞內(nèi)段存在兩個(gè)潛在的N連接糖基化位點(diǎn)和3個(gè)半胱氨酸位點(diǎn),在不同物種中高度保守。

近來(lái),BST-2在多種非靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物包括牛、羊、貓中鑒定出來(lái)[18-21]。它們都顯示出了較強(qiáng)的抗病毒活性。梅花鹿在亞洲尤其中國(guó)是一種重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物,病毒對(duì)鹿群的感染會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。鹿科動(dòng)物宿主限制因子的研究目前尚無(wú)報(bào)道。本研究中通過(guò)克隆梅花鹿BST-2基因,構(gòu)建其真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染表達(dá),為研究BST-2的抗病毒功能以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能提供了有力的工具。

1 材料與方法

1.1 材料 E.coli DH5α菌株、表達(dá)載體VR1012和293T細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。淋巴細(xì)胞提取液,TRIZol和雙抗,購(gòu)自Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR相關(guān)試劑、pMD-18 T Vector、DNA連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶、膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒等,購(gòu)自TaKaRa公司;轉(zhuǎn)染試劑 Fugene?6,購(gòu)自 Promega公司;鼠抗Tubulin單克隆抗體和鼠抗HA單克隆抗體,購(gòu)自Covance公司;Alexa Fluor 488綠色熒光標(biāo)記二抗,購(gòu)自Thermo Fisher公司;堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗小鼠二抗,購(gòu)自Jackson公司;DAPI,購(gòu)自Roche公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司;細(xì)胞爬片、6孔板,購(gòu)自Nest公司;其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或進(jìn)口分裝試劑。PCR引物由長(zhǎng)春華大中天生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM中培養(yǎng),培養(yǎng)條件為37℃,5%CO2濃度。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞使用胰酶消化,離心收集,接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中。至匯合度達(dá)到70%,使用Fugene?6轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞。

1.2.2 RNA提取及基因擴(kuò)增 使用淋巴細(xì)胞提取液分離鹿血中的淋巴細(xì)胞,TRIZol法提取總RNA,使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA提取情況,Nano測(cè)定RNA濃度。以轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的序列設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,片段進(jìn)行膠回收并連入pMD-18 T亞克隆載體。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,挑單克隆,過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,進(jìn)行雙酶切鑒定以及測(cè)序鑒定。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 使用Vector NTI軟件分析梅花鹿BST-2蛋白的氨基酸組成,相對(duì)分子質(zhì)量以及等電點(diǎn)等理化性質(zhì),以及不同種屬間BST-2的同源性。使用在線(xiàn)軟件TMHMM 2.0、NetNGlyc、SWISS-MODLE以及SUMOplot分析BST-2蛋白的跨膜區(qū)、糖基化位點(diǎn)、二聚位點(diǎn)和泛素化位點(diǎn)。

1.2.4 引入IHA標(biāo)簽構(gòu)建真核表達(dá)載體 取測(cè)序正確的pMD18T-BST-2質(zhì)粒進(jìn)行Overlap PCR,在第132個(gè)氨基酸后引入HA標(biāo)簽,所得產(chǎn)物經(jīng)膠回收后使用Xba I和BamH I切去保護(hù)堿基,酶切產(chǎn)物純化后使用T4 DNA連接酶與真核表達(dá)載體VR1012連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,挑取單克隆,過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,進(jìn)行雙酶切鑒定以及測(cè)序鑒定。

1.2.5 點(diǎn)突變PCR 設(shè)計(jì)不同突變引物,以VR1012-BST-2 IHA為模板,進(jìn)行PCR反應(yīng),所得產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,使用Dpn I消化,去除模板DNA,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,挑取單克隆,過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,進(jìn)行雙酶切鑒定以及測(cè)序鑒定。

1.2.6 免疫印跡 轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞,Rippa裂解液裂解細(xì)胞,加入上樣緩沖液煮沸10 min致蛋白變性,利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品。通過(guò)半干轉(zhuǎn)儀將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂牛奶封閉30 min,一抗孵育過(guò)夜,二抗孵育45 min。加入酶聯(lián)二抗的顯色底物,至特異性條帶清晰可見(jiàn),終止顯色反應(yīng)。

1.2.7 免疫熒光 293T細(xì)胞鋪于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,待細(xì)胞匯合度至20% ～50%時(shí)使用Fugene?6轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染相關(guān)質(zhì)粒。24 h后棄去上清,4%多聚甲醛室溫固定10 min。棄去固定液,10%FBS封閉10 min。一抗孵育1～2 h。二抗孵育1 h。PBS沖洗3次。加入含有1μg/mL 4′,6-二脒基 -2-苯基吲哚 （DAPI）的PBS,孵育5 min后用PBS沖洗一次。使用熒光顯微鏡采集熒光圖像,分析蛋白的細(xì)胞定位情況。

2 結(jié)果

2.1 BST-2 cDNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果 在梅花鹿轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得預(yù)測(cè)的梅花鹿BST-2基因序列并設(shè)計(jì)引物。從梅花鹿PBMC中提取總RNA,Nano測(cè)定OD260/280值為1.88,瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)三條條帶,分別為28S、18S和5S（圖1,第3泳道）,說(shuō)明RNA純度較高且無(wú)降解。使用反轉(zhuǎn)錄PCR法獲得cDNA,以其為模板,引物如表1所示,進(jìn)行PCR反應(yīng)。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析,在500 bp左右可見(jiàn)一特異性條帶（圖1,第2泳道）,符合預(yù)期大小。

表1 試驗(yàn)用引物

圖1 梅花鹿BST-2基因擴(kuò)增示意圖

2.2 真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定結(jié)果 回收PCR產(chǎn)物并連接pMD18-T亞克隆載體。重組質(zhì)粒經(jīng)Xba I和BamH I雙酶切鑒定,在500 bp和2 000～3 000 bp兩處可見(jiàn)特異性條帶（圖2,第2道）,說(shuō)明目的片段插入成功。使用通用引物測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中序列匹配率為100%。使用Overlap PCR引物,分別獲得BST-2 N端和C端兩個(gè)片段,且這兩個(gè)片段都帶有HA序列,回收后的這兩個(gè)片段利用HA序列為互補(bǔ)區(qū)進(jìn)行Overlap PCR反應(yīng),獲得具有內(nèi)部HA（IHA）的BST-2片段（圖2,第3道）,將這個(gè)片段連入真核表達(dá)載體VR1012中,進(jìn)行雙酶切鑒定,在5000 bp和500 bp處分別可見(jiàn)特異性條帶（圖2,第5道）,證明構(gòu)建成功。將質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn),在第132位氨基酸后確實(shí)連入了HA標(biāo)簽,證明構(gòu)建成功。

2.3 梅花鹿BST-2基因及蛋白序列分析 梅花鹿BST-2基因包含480個(gè)堿基,編碼159個(gè)氨基酸。蛋白質(zhì)理論分子量為17.69 kDa,預(yù)測(cè)等電點(diǎn)為5.66。對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,可知其含有70.44% α-螺旋,9.43% β-片層,1.26%的β-折疊和18.87%的無(wú)規(guī)卷曲。將梅花鹿BST-2催化域與不同物種的BST-2進(jìn)行同源性比較,得出蛋白同源性分別為37.8%、30.1%、67.3%、74.2%和53.1%。說(shuō)明在進(jìn)化上梅花鹿BST-2與羊的BST-2A較為接近（圖3）。使用生物信息學(xué)軟件對(duì)梅花鹿BST-2進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)其具有兩個(gè)穿膜區(qū),其中1～14位氨基酸是胞內(nèi)段,15-37位氨基酸是跨膜區(qū),38～135位氨基酸是胞外段。一個(gè)可能的泛素化位點(diǎn)（K96,閾值為0.5）,三個(gè)保守的半胱氨酸殘基（C46,C56,C84）,對(duì)其二聚結(jié)構(gòu)具有重要作用,兩個(gè)潛在的N-連接糖基化位點(diǎn)（N85,N137）（見(jiàn)中插彩版圖4）。

圖2 真核表達(dá)載體質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定示意圖

圖3 不同種屬間BST-2氨基酸序列同源性比對(duì)

2.4 BST-2突變體的構(gòu)建及鑒定 對(duì)梅花鹿BST-2的六個(gè)潛在功能位點(diǎn)進(jìn)行突變,設(shè)計(jì)這幾個(gè)氨基酸突變至丙氨酸的引物,以VR1012-BST-2 IHA為模板,使用pfu酶對(duì)這幾個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行突變PCR,瓊脂糖凝膠電泳顯示均在4 000～7 000 bp處獲得了擴(kuò)增產(chǎn)物（圖5）,經(jīng)過(guò)測(cè)序證明,PCR產(chǎn)物均突變成功。

圖5 梅花鹿BST-2突變體的構(gòu)建

2.5 免疫印跡分析結(jié)果 人BST-2、梅花鹿BST-2野生型以及突變體真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,48小時(shí)后收取細(xì)胞進(jìn)行Western Blotting分析,結(jié)果表明,與人BST-2類(lèi)似,梅花鹿BST-2在WB分析中展示出三條帶的特征（圖6,第2道）,分布于20～35 kDa之間。這可能是由于N-連接糖基化現(xiàn)象導(dǎo)致的。在對(duì)潛在的糖基化位點(diǎn)N85和N137進(jìn)行突變后發(fā)現(xiàn),BST-2的糖基化現(xiàn)象減少,變成了兩條帶（圖六,第7、8道）。三個(gè)半胱氨酸殘基以及K96A的突變對(duì)其蛋白表達(dá)形式?jīng)]有影響（圖6,第3至第6道）。

圖6 BST-2在293T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的Western Blot分析

2.6 細(xì)胞表面表達(dá)分析結(jié)果 通過(guò)熒光顯微鏡觀察可見(jiàn),與轉(zhuǎn)染空載體的陰性對(duì)照相比,轉(zhuǎn)染了梅花鹿BST-2表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞表面明顯可見(jiàn)綠色熒光（中插彩版圖7）,說(shuō)明梅花鹿BST-2與人BST-2相同,能夠在細(xì)胞膜表面表達(dá),是一種膜蛋白。

3 討論

本研究通過(guò)對(duì)梅花鹿外周血淋巴細(xì)胞中BST-2基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增以及分子克隆,首次獲得了梅花鹿BST-2基因的編碼區(qū),長(zhǎng)度為480 bp編碼159個(gè)氨基酸。通過(guò)同源性對(duì)比發(fā)現(xiàn),梅花鹿BST-2蛋白氨基酸序列與牛和羊的BST-2A蛋白氨基酸序列同源性相對(duì)較高,分別為67.3%和74.2%。而與其他物種的同源性較低,為30% ～60%。近來(lái)的報(bào)道認(rèn)為,BST-2的抗病毒活性主要依賴(lài)于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征,而非氨基酸序列,這解釋了為什么BST-2在物種間的序列同源性較低。通過(guò)生物信息學(xué)軟件分析,梅花鹿BST-2蛋白為兩次跨膜蛋白,具有三個(gè)潛在的二聚化位點(diǎn),兩個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)以及一個(gè)潛在的泛素化位點(diǎn)。對(duì)潛在糖基化位點(diǎn)突變引起了BST-2蛋白在免疫印跡中高分子量條帶減少,暗示了糖基化的抑制。

BST-2是一個(gè)兩端跨膜蛋白,且N端胞漿區(qū)具有重要的功能,因此無(wú)論N端還是C端均不適合引入標(biāo)簽。為了更好的對(duì)其進(jìn)行檢測(cè),我們引入了HA標(biāo)簽在其胞外段,并連入VR1012載體。通過(guò)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞以及免疫印跡分析,可以看到BST-2在細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá),免疫熒光分析證實(shí)了梅花鹿BST-2確實(shí)是一個(gè)膜蛋白,可以在細(xì)胞膜表面表達(dá)。

BST-2抑制包膜病毒釋放的能力使其抗病毒譜非常廣泛,梅花鹿作為一種重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物和保護(hù)動(dòng)物,其抗病毒相關(guān)蛋白一直較少報(bào)道。本研究的發(fā)現(xiàn)填補(bǔ)了這一空白,為未來(lái)進(jìn)一步研究梅花鹿相關(guān)病毒限制因子及其生物學(xué)活性奠定了基礎(chǔ)。