以堿性聚合酶2(PB2)為靶點(diǎn)的抗流感病毒藥物的虛擬篩選

王 強(qiáng)，石 橋，劉 金

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢 430074)

流感病毒可分為A,B,C三型，A型流感能頻繁引起全國(guó)性和季節(jié)性流感，豬類和禽類都可以作為A型流感的宿主；B型流感能引起流行性感冒甚至可導(dǎo)致人類死亡，尤其是兒童[1-3].美國(guó)抗流感病毒藥物的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)是神經(jīng)氨酸酶抑制劑(NAIs)奧司他韋和扎那米韋，這些藥物對(duì)于A型和B性流感有效，但神經(jīng)氨酸酶抑制劑對(duì)于嚴(yán)重病癥效果輕微，必須在感染的24～48 h內(nèi)攝入[4]，且易產(chǎn)生耐藥性[5]，尤其是H5N1流感已經(jīng)表現(xiàn)出了對(duì)奧司他韋的耐藥性[6].

流感病毒基因組含有8個(gè)RNA片段，可編碼11種病毒蛋白質(zhì)，由PA,PB1和PB2這3個(gè)亞基組成的聚合酶復(fù)合體是病毒基因組RNA復(fù)制和mRNA轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵組分，由于它突變率低、高度保守，成為抗流感病毒藥物設(shè)計(jì)的重要靶點(diǎn).在宿主細(xì)胞核中，這種聚合酶通過一種稱為“cap-snatching”的方式來轉(zhuǎn)錄vRNA[7].在轉(zhuǎn)錄過程中，PB2的帽結(jié)合區(qū)域結(jié)合到宿主前信使5′端帽子結(jié)構(gòu)上[8]，帽子和帽子下游的10～13核苷酸被聚酰胺的N端核酸內(nèi)切酶區(qū)域分開，隨后產(chǎn)生的5′帽子RNA片段被PB1亞基用作合成的病毒mRNA的引物[9, 10]. PB2通過影響“cap-snatching”的轉(zhuǎn)錄過程對(duì)病毒復(fù)制十分重要，對(duì)帽結(jié)合、核酸內(nèi)切酶或聚合酶的抑制劑，都是抗病毒治療的潛在手段，成為積極研發(fā)的作用靶點(diǎn)[11, 12].

PB2成為抗病毒治療的靶點(diǎn)不久后，Michael P. Clark以環(huán)烷基并哌啶基氯氮雜吲哚為母核進(jìn)行優(yōu)化，得到化合物VRT-0761704，m7GTP和VRT-0761704與PB2的帽結(jié)合區(qū)域結(jié)合的X光晶體結(jié)構(gòu)被成功確認(rèn)[3].盡管分屬于不同空間的PB2帽結(jié)合部分,但與之前m7GTP 的結(jié)果一致[13]，結(jié)構(gòu)揭示VRT-0761704占據(jù)了m7GTP的結(jié)合區(qū)域并產(chǎn)生同m7GTP鳥嘌呤相似的與蛋白質(zhì)之間的連接.Michael P.Clark的實(shí)驗(yàn)顯示m7GTP和VRT-0761704均與側(cè)鏈GLU361和LYS376形成氫鍵.VRT-0761704的氮雜吲哚部分被夾在芳香性側(cè)鏈HIS357和PHE404，嘧啶環(huán)上的大π鍵與PHE323排斥.VRT-0761704的二甲基丙酰胺位m7GTP的核糖和α-磷酸鹽附近.同時(shí)，他們還發(fā)現(xiàn)化合物VX-787也在體外表型細(xì)胞保護(hù)試驗(yàn)中對(duì)大多數(shù)A型流感表現(xiàn)出強(qiáng)力的抗病毒活性——包括對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制劑和金剛烷胺有耐藥性的流行性流感H1N1和H5N1，并且活性只針對(duì)A型流感，對(duì)B型流感只有微弱的作用[14](見圖1).

SPECS數(shù)據(jù)庫(kù)(www.specs.net)由荷蘭SPECS公司于1987年開發(fā)，其中所有化合物均可在SPECS公司購(gòu)買，數(shù)據(jù)庫(kù)會(huì)根據(jù)各個(gè)化合物的庫(kù)存量定期更新.為了使篩選的結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，防止漏篩，本研究針對(duì)已報(bào)道的兩種大分子結(jié)構(gòu)相同但結(jié)合小分子不同的晶體結(jié)構(gòu)，以PB2為靶點(diǎn)，使用分子對(duì)接技術(shù)篩選數(shù)據(jù)庫(kù)中潛在的抑制劑，發(fā)現(xiàn)2個(gè)高活性的PB2抑制劑，探討了抑制劑與PB2之間的結(jié)合模式，對(duì)以PB2為靶點(diǎn)的抗病毒藥物研究有重要意義.

圖1 堿性聚合酶2抑制劑Fig.1 PB2 inhibitors

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 配體小分子的準(zhǔn)備

利用SPECS數(shù)據(jù)庫(kù)(www.specs.net)設(shè)定：1)化合物的分子量不大于550；2)化合物結(jié)構(gòu)中的氫鍵供體(包括羥基、氨基等)的數(shù)量不大于5個(gè)；3)化合物中氫鍵受體的數(shù)量不大于10個(gè)；4)化合物的脂水分配系數(shù)的對(duì)數(shù)值(logP)不大于5；5)必須含有1個(gè)以上芳環(huán)結(jié)構(gòu).初篩找出282717個(gè)化合物的3維數(shù)據(jù)建成數(shù)據(jù)庫(kù)，所有分子構(gòu)建和對(duì)接計(jì)算模塊均在方正文祥E520計(jì)算機(jī)上，使用SYBYL軟件包完成，計(jì)算中使用的各項(xiàng)參數(shù)除非特別說明均采用缺省值.

1.2 流感病毒PB2亞基結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備

從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org)中搜索到流感病毒PB2的2種晶型[3]：4NCM和4P1U，下載它們的三維數(shù)據(jù)，保存為4NCM.pdb和4P1U.pdb.使用sybyl軟件對(duì)流感病毒PB2蛋白晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)處理，去掉邊緣的水分子，加上氫原子，對(duì)蛋白質(zhì)分子加載AMBER7 FF99電荷，并對(duì)原有小分子抑制劑加載Gasteiger-Hückel電荷，其中電荷類型與預(yù)處理一致.在晶體結(jié)構(gòu)中提取原有小分子抑制劑的結(jié)構(gòu)，用來確定對(duì)接位點(diǎn).

1.3 配體小分子的虛擬篩選和分子對(duì)接

將數(shù)據(jù)庫(kù)中的化合物分子作為配體，使用SYBYL SurFlex模塊與PB2晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)接，選擇對(duì)接區(qū)域模式為ligand，以上文中提取出的4CNM-ligand.mol2為引導(dǎo)文件.點(diǎn)選generate生成探針文件，確定jobname為4NCM開始分子對(duì)接，將對(duì)接結(jié)果之一的打分圖保存，并將打分靠前的3個(gè)化合物與4NCM結(jié)合的文件用Discovery Studio 4.1 Client打開，標(biāo)示出活性位點(diǎn)的空間構(gòu)象，受體與供體的連接作用方式，截圖保存.

2 結(jié)果與討論

2.1 配體小分子虛擬篩選結(jié)果

配體小分子虛擬篩選結(jié)果見圖2.

2.2 分子對(duì)接分析

配體小分子AO-022/43453673與4NCM的對(duì)接結(jié)果見圖3.由圖3可見，該化合物分子內(nèi)形成氫鍵，用于穩(wěn)定分子構(gòu)型.分子中苯環(huán)上的甲氧基與SER321上的羥基形成氫鍵，胍基上的氫與GLU361的氧形成氫鍵，嘧啶環(huán)與LYS376形成氫鍵.嘧啶環(huán)上的羥基同時(shí)與LYS376和PHE404形成氫鍵.此外，分子中的嘧啶環(huán)還與HIS357和PHE404存在π-π相互作用，苯環(huán)與PHE325存在π-π相互作用，進(jìn)一步增加了小分子與蛋白質(zhì)結(jié)合的穩(wěn)定性.

圖2 對(duì)接結(jié)果Fig.2 Docking results

配體小分子AN-655/14860175與4NCM的對(duì)接結(jié)果見圖4.由圖4可見，配體小分子與蛋白質(zhì)晶體形成氫鍵而牢固地固定在腔體中，分子中的甲氧基與ASN429的氨基形成氫鍵.除氫鍵外，分子中的苯環(huán)、咪唑、四氫咪唑環(huán)與HIS357,PHE323和PH404中存在π-π相互作用，極大地增強(qiáng)了小分子的活性.此外，分子還與HIS357,PHE323和PHE404存在疏水作用力.

圖3 配體小分子AO-022/43453673與4NCM的對(duì)接結(jié)果Fig.3 Docking result of small ligand molecule AO-022/43453673 and 4NCM

圖4 配體小分子AN-655/14860175與4NCM的對(duì)接結(jié)果Fig.4 Docking result of small ligand molecule AN-655/14860175 and 4NCM

3 結(jié)語(yǔ)

結(jié)合本文虛擬分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Michael P. Clark研究發(fā)現(xiàn)的化合物VX-787的結(jié)合情況可知：對(duì)接結(jié)果較好的小分子化合物的共同特征是含有多羥基和羰基，能與活性中心的多處氨基酸殘基形成氫鍵，分子中的芳環(huán)或芳雜環(huán)多能與HIS357, PHE404, PHE323之間存在π-π相互作用，并被活性位點(diǎn)附近殘基組成的疏水口袋包圍，使化合物分子與活性中心結(jié)合更加緊密，抑制作用更強(qiáng).側(cè)鏈引入苯環(huán)等疏水基團(tuán)能與活性中心的氨基酸殘基形成較強(qiáng)的疏水作用力，這是化合物產(chǎn)生作用的關(guān)鍵.Zincs數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)為AO-022/43453673，AN-655/14860175等打分排名靠前的化合物均具備潛在的治療流感病毒的能力，可作為抗流感病毒新藥的小分子.