肝泡型包蟲病患者體液免疫變化的研究*

馬 婕,冀林華,劉文靜,崔 森△,樊海寧▲

(1.青海大學附屬醫(yī)院,西寧 810001;2.青海大學醫(yī)學院高原醫(yī)學研究中心,西寧 810001)

包蟲病是常見的人畜共患病，是由棘球絳蟲幼蟲-棘球蚴寄生而致的，又稱棘球蚴病。引起人感染的主要是細粒棘球蚴和多房棘球蚴，又分別稱為囊型(cystic echinococcosis，CE)和泡型包蟲病(alveolar echinococcosis，AE)[1-2]。人體在感染棘球蚴過程中宿主-寄生蟲之間的相互作用關系十分復雜[3]。目前對棘球蚴與宿主的免疫反應有許多研究結果，但大多集中在細胞免疫方面，而對體液免疫的研究還比較少。寄生蟲在宿主體內生長離不開體液免疫的調節(jié)，B細胞作為機體體液免疫的重要細胞，通過提呈抗原、產生抗體以及分泌細胞因子實現(xiàn)其價值[4-5]。本文通過研究肝泡型包蟲病(HAE)患者外周血B淋巴細胞部分表面抗原的表達及所分泌的抗體水平變化，探討HAE患者體液免疫的變化情況。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取30例2015年12月至2016年12月在青海大學附屬醫(yī)院影像中心初步診斷但未治療的HAE患者(HAE組)，男17例，女13例，平均年齡41.5歲(18～69歲)，回顧手術后確診為HAE患者。排除標準[6]：(1)感染性疾病(細菌、病毒等)；(2)惡性腫瘤；(3)風濕免疫性疾病患者；(4)合并囊型包蟲病及其他寄生蟲疾病患者；(5)應用非甾體類抗炎藥、激素類藥物、精神病治療藥物等。同時選取30例本院體檢的健康人為正常對照組，其中男16例，女14例，平均年齡42.5歲(19～65歲)，行血常規(guī)、肝腎功能、心電圖及B超等檢查示均正常。本研究經青海大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準，抽血及化驗均征得受試者同意并簽署知情同意書。

1.2試驗方法

1.2.1儀器與試劑 流式抗體CD19-FITC、CD20-PE均購自美國BD公司，10×紅細胞裂解液購自中國聯(lián)科生物公司，IgG、IgM、IgA均購自美國Thermo Fisher公司，流式細胞購自艾森生物公司，蛋白分析儀購自德國西門子公司，純水制備系統(tǒng)購自美國Millipore公司，電子天平購自美國Bio-Rad公司，渦旋混合儀購自美國Scientific Industries公司。標記筆、采血管、試管、各種規(guī)格的移液器及槍頭等。

1.2.2主要溶液配制方法 (1)1×紅細胞裂解液：用純水900 mL溶解100 mL 10×紅細胞裂解液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?2)PBS溶液：將PBS粉末緩沖體系充分溶于超純水，配制成1×PBS緩沖液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3流式細胞儀檢測B淋巴細胞抗原表達 取100 μL EDTA抗凝全血加入流式細胞分析專用試管，加入10 μL CD19-FITC、10 μL CD20-PE后混勻，室溫避光反應15 min，再加入1 mL紅細胞裂解液，室溫避光反應10 min后，離心棄上清液，加入2 mL 1×PBS洗滌1次后以300 μL PBS重懸細胞，用艾森生物ACEA NovoCyteTM流式細胞儀進行FCM測定，在FSC/SSC圖上設門去除碎片及死細胞，然后測定CD19+、CD20+B淋巴細胞的百分率，用NovoExpress軟件獲取、分析數(shù)據(jù)。

1.2.4檢測IgG、IgM、IgA 抽取外周血2～3 mL于含纖維蛋白酶促凝劑的管中(橘黃色管蓋)，應用西門子BNⅡ全自動特定蛋白分析儀檢測IgG、IgM、IgA的表達水平。

2 結 果

2.1兩組外周血B淋巴細胞的比率 HAE組患者外周血CD19+B淋巴細胞比率為(2.18±0.82)%，正常對照組為(9.26±3.40)%，二者比較HAE組顯著低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。 CD20+B淋巴細胞比率為(2.88±1.05)%，正常對照組為(4.54±1.26)%，二者比較HAE組顯著低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖1、2。

A：設門于淋巴細胞；B：HAE患者外周血CD19+B淋巴細胞比率；C：HAE患者外周血CD20+細胞B淋巴比率

A：設門于淋巴細胞；B：正常對照組外周血CD19+B淋巴細胞比率；C：正常對照組外周血CD20+B淋巴細胞比率

2.2HAE組與正常對照組免疫球蛋白水平比較 HAE組IgG為(23.99±7.08)g/L，IgA為(3.23±1.68)g/L，正常對照組IgG為(11.13±2.30)g/L，IgA為(2.14±1.02)g/L，二組相比HAE組IgG、IgA水平均明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而HAE組IgM為(1.26±0.36)g/L，正常對照組為(1.78±0.80)g/L，二者相比HAE組IgM水平低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 HAE組與正常對照組免疫球蛋白水平比較

3 討 論

包蟲病被認為是一種世界性公共衛(wèi)生問題，在我國以新疆、內蒙古、青海等畜牧業(yè)發(fā)達地區(qū)多發(fā)，嚴重影響當?shù)氐慕洕l(fā)展及居民健康[7]。包蟲病在人類的傳播過程中，人作為中間宿主，誤食了被狗或狐貍等宿主的糞便排出的寄生蟲卵污染的蔬菜或水源，蟲卵在人小腸內孵化并鉆入腸壁，隨血流到達肝、肺、腦等臟器并寄生，其中以在肝臟內寄生最為多見，稱為HEA，在青海地區(qū)HEA較其他地區(qū)多見[8]。

在人體被泡球蚴感染后寄生蟲長期在宿主體內寄生，能刺激宿主免疫系統(tǒng)發(fā)生特殊的變化，棘球絳蟲長期寄生于宿主體內，為了抵抗宿主免疫系統(tǒng)的殺傷，包蟲能引起宿主免疫系統(tǒng)發(fā)生一系列免疫反應，宿主和包蟲的免疫系統(tǒng)都做出了相應調整才能達到動態(tài)平衡的“共生”狀態(tài)。在泡球蚴感染的早期，為了避免自身遭受傷害，宿主通過體內免疫細胞的增殖及分化使淋巴細胞轉化功能增強，有排除異己、控制泡球蚴早期生長和轉移的作用；而隨著病程的進展，淋巴細胞轉化功能有所下降，宿主的免疫反應受抑制，泡球蚴在體內長期寄生并發(fā)育[9]。

既往的研究中，細胞因子如白細胞介素(IL)-2、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(INF-γ)等在肝包蟲病免疫中的作用得到闡明，這些細胞因子對肝包蟲病的發(fā)病機制及對疾病的嚴重程度、療效及預后有重要意義[10]。目前還沒有發(fā)現(xiàn)關于人體感染包蟲后抗體反應的結論性信息，包蟲感染能引起人體外周血循環(huán)中IgG、IgM、IgA和IgE的變化，有學者指出肝包蟲病患者免疫球蛋白水平變化結合超聲影像學表現(xiàn)，對后續(xù)診斷及治療工作有一定的幫助[11]。

本試驗對HAE患者的體液免疫進行了研究，比較了HEA患者外周血成熟B細胞變化及血清IgG、IgA、IgM等抗體的水平與健康人的區(qū)別。以CD19+、CD20+標記外周血成熟B細胞，用流式細胞儀測定外周血中CD19+、CD20+表達量，結果表明HAE患者CD19+、CD20+陽性率明顯低于正常對照組，說明泡球蚴在體內寄生過程中，淋巴細胞比例下降，宿主的免疫反應處于抑制狀態(tài)，使得泡球蚴能在宿主內長期寄生并發(fā)育。

寄生蟲侵入宿主機體后首先表現(xiàn)IgM上升，IgM是一種大分子抗體，相對分子質量最大，故稱之為巨球蛋白，IgM能清除血流中的原蟲顆粒，為一種凝集性抗體，是直接、間接凝集實驗的診斷要素。張永紅等[12]在小鼠腹腔接種棘球蚴原頭節(jié)后，在未發(fā)育形成囊泡前30 d能測到低效價的IgM血清抗體，90 d后隨著囊泡不斷長大，IgM開始降低。本研究中HAE患者血清IgM抗體較正常對照組降低，考慮包蟲在宿主體內長期寄生，宿主的免疫抑制，導致IgM下降。

繼IgM后，IgG水平明顯升高，IgG是一種保護性抗體，在免疫過程中占主導地位，可與相應抗原發(fā)生特異性結合，中和蟲體毒素，對蟲體起殺傷作用。寄生于不同組織器官的包蟲誘導宿主產生抗體的類型也不同，表現(xiàn)為肝包蟲的主要是IgG抗體，肺包蟲主要是IgM抗體[13]。IgG包括4種不同類型，分別為IgG1～4，既往研究表明隨著疾病進展，IgG1和IgG3水平逐漸降低，而IgG2和IgG4在整個疾病過程中均保持著類似的高度[14]。IgA存在兩種形式——血清型IgA和分泌性IgA，血清型IgA具有抗蟲體毒素的作用；分泌性IgA在保護機體胃腸道、呼吸道等黏膜免疫器官受蟲體入侵時起到關鍵作用。GUO等[15]研究發(fā)現(xiàn)IL-6能促進IgA的分泌，而近年來研究資料表明，肝包蟲病患者血清IL-6水平較健康人明顯升高，可能是倒導致IgA水平增高的原因之一。

在本研究中HAE患者血清IgM抗體較正常對照組降低，而IgG和IgA則較正常對照組明顯升高，考慮包蟲在宿主體內長期寄生的過程中刺激機體產生強弱不等的免疫應答反應，隨著包蟲囊增大和包蟲寄生數(shù)量的增多，抗體陽性率也隨之變化[16]。在人體感染包蟲后發(fā)生的免疫反應與疾病的性質和特點相關，這個特性提供了一個重要的優(yōu)勢，使得免疫系統(tǒng)針對特定群體的傳染病病原體能夠調整其防御策略。

目前，盡管HAE進展的分子機制尚不明確，但有大量基礎研究結果顯示體液免疫及細胞免疫參與其進展。HAE的免疫相當復雜，只有清楚地了解了其免疫機制，才能更有效地尋找抑制包蟲感染的辦法，從而控制其傳播。