一株苯酚降解菌株的篩選鑒定及特性研究

任瑞凡　劉永陽(yáng)　曲文浩　孔令騰　李瀟瀟　薛智權(quán)　呂建華

摘 要：為了從焦化廢水活性污泥中篩選出高效降酚的細(xì)菌，以對(duì)廢水中苯酚進(jìn)行生物處理。以苯酚為唯一碳源，從太谷縣某焦化廠活性污泥中篩選苯酚降解菌，同時(shí)通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)合正交試驗(yàn)分析，確定該菌株降解苯酚的最佳條件，通過(guò)酶活性測(cè)定推測(cè)菌株降解途徑。結(jié)果從活性污泥中分離得到1株苯酚降解菌株B10，經(jīng)分析16S rDNA序列和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，初步鑒定該菌株為芽孢桿菌屬細(xì)菌。通過(guò)利用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)合正交試驗(yàn)分析，確定該菌株降解苯酚的最佳條件為：酵母膏10 g·L-1，乙醇4 g·L-1，初始接菌量2.5%，培養(yǎng)溫度30 ℃，硫酸鎂1 g·L-1。當(dāng)以苯酚為唯一碳源時(shí)，菌株B10中僅有鄰苯二酚1， 2-雙加氧酶活性被檢測(cè)到，因此推測(cè)，該菌株通過(guò)鄰位途徑降解苯酚。結(jié)果表明，B10菌具有降解苯酚能力，對(duì)于治理含酚廢水具有應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：苯酚；芽孢桿菌屬B10；Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)；鄰苯二酚1， 2-雙加氧酶活性

中圖分類(lèi)號(hào)：X172 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.11.004

Study on Screening， Identification and Characterization of A Phenol-degrading Bacterium Strain

REN Ruifan， LIU Yongyang， QU Wenhao， KONG Lingteng， LI Xiaoxiao， XUE Zhiquan， LYU Jianhua

（College of Life Science，Shanxi Agricultural University，Taigu， Shanxi 030801，China）

Abstract： The purpose of this paper is to screen highly effective phenol-degrading bacteria from the activated sludge of coking wastewater for the treatment of phenol in wastewater. The paper took phenol as the sole carbon source， by utilizing phenol as sole carbon source， screening phenol-degrading bacteria from the active sludge of coking plant in Taigu county of Shanxi province， at the same time， the optimum conditions for degradation of phenol were determined by Plackett-Burman experimental design and orthogonal test analysis， and the degradation pathway of the strain was determined by enzyme activity detection. The results showed that a phenol-degrading bacterium strain B10 was isolated from the active sludge. Based on the analysis of the 16S rDNA sequence and the construction of the phylogenetic tree， the strain was identified as Bacillus. Utilizing the Plackett-Burman design， together with orthogonal test analysis， it was confirmed that the optimum degradation conditions of the strain were yeast extract 10 g·L-1， ethanol 4 g·L-1， inoculation volume 2.5%， temperature 30 ℃， magnesium sulphate 1 g·L-1. When phenol was the only carbon source， only catechol 1， 2-dioxygenase activity in strain B10 was detected. Therefore， it was speculated that the strain might metabolize phenol via ortho-cleavage pathway. The results showed that B10 could degrade phenol and had potential application in the treatment of phenolic wastewater.

Key words： phenol； Bacillus sp. B10； Plackett-Burman； catechol 1， 2-dioxygenase activity

苯酚及其衍生物是各種有機(jī)化合物的基本結(jié)構(gòu)單元，作為原料已被廣泛應(yīng)用于石油化工、醫(yī)藥、印染、造紙等行業(yè)，其工業(yè)廢水成為含酚廢水的主要來(lái)源[1-3]。研究表明，即使是極低濃度的苯酚也會(huì)使飲用水產(chǎn)生令人反感的味道。當(dāng)酚類(lèi)及其衍生物濃度在5～2 000 mg·L-1時(shí)，對(duì)所有生命體都具有強(qiáng)烈毒性。因此，酚類(lèi)物質(zhì)被確定為優(yōu)先污染物[4-7]。去除工業(yè)廢水中的苯酚對(duì)環(huán)境保護(hù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

采用微生物降解苯酚已經(jīng)進(jìn)行了至少20年的嘗試。有研究表明，許多細(xì)菌和酵母菌能夠耐受和降解低濃度的苯酚，并且將酚類(lèi)化合物分解代謝成無(wú)害的最終產(chǎn)物，因此，微生物降解是非常有效的處理含酚廢水的方法[8]。目前，國(guó)內(nèi)外分離和鑒定到的降解苯酚的微生物包括細(xì)菌和真菌兩大類(lèi)。其中，細(xì)菌159 種，分屬于42個(gè)屬；真菌53 種，分屬于15個(gè)屬。細(xì)菌以假單胞菌屬的菌株最多，其次是芽孢桿菌屬、產(chǎn)堿菌屬、紅球菌屬和不動(dòng)桿屬；真菌以酵母屬最多，其次是假絲酵母屬[9]。

采用微生物降解工業(yè)廢水中的苯酚時(shí)，其降解效果會(huì)受到許多因素的影響。因此，需要從這些因素中篩選影響顯著的因素。采用單因素不能確定主要因素和次要因素，而Plackett-Burman試驗(yàn)?zāi)軌驈闹T多因素中快速有效地篩選出最重要的因素[10-11]。

通過(guò)對(duì)山西農(nóng)業(yè)大學(xué)所在地太谷縣某焦化廠廢水池中的活性污泥進(jìn)行采集，采用初篩、復(fù)篩的方法篩選出高效降酚的細(xì)菌，并通過(guò)Plackett - Burman試驗(yàn)篩選影響菌降解苯酚的重要因素，利用正交設(shè)計(jì)對(duì)重要因素進(jìn)一步優(yōu)化，以篩選出影響菌株苯酚降解率的最佳相關(guān)因素，同時(shí)對(duì)苯酚降解酶活性進(jìn)行測(cè)定，旨在為含酚廢水的治理提供重要的理論和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來(lái)源 研究所用樣品采自于山西省晉中市太谷縣某焦化廠廢水處理池中的活性污泥，污泥裝入滅菌后的三角瓶中封好，放4 ℃冰箱保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 （1）富集培養(yǎng)基。 牛肉膏3 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，NaCl 5 g·L-1，調(diào)pH值為7.0，加水定容，高壓蒸汽滅菌，121 ℃，滅菌20 min，冷卻后加入兩性霉素0.002 5 g·L-1，苯酚1 g·L-1。（2）無(wú)機(jī)鹽篩選培養(yǎng)基。 K2HPO4 0.4 g·L-1，KH2PO4 0.2 g·L-1，NaCl 0.1 g·L-1，MgSO4 0.1 g·L-1，MnSO4·H2O 0.01 g·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.01 g·L-1，酵母提取物2.5 g·L-1，瓊脂粉15～20 g·L-1，加水定容，高壓蒸汽滅菌，121 ℃，滅菌20 min，冷卻后加入兩性霉素0.002 5 g·L-1，苯酚根據(jù)需要量加入。

1.1.3 試劑 試驗(yàn)所用化學(xué)試劑均為分析純，酵母提取物購(gòu)自O(shè)XOID公司，細(xì)菌DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，PCR試劑購(gòu)自北京康為世紀(jì)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 苯酚含量的測(cè)定 采用4-氨基安替比林法[12]測(cè)定苯酚含量，略有改進(jìn)。將培養(yǎng)液于12 000 r·min-1離心1 min后，取上清30 μL加入到10 mL試管中，加蒸餾水到4 mL，加入40 μL pH值為10的氨水緩沖溶液，加80 μL 2%的4-氨基安替比林，混勻，再加入80 μL 8%的鐵氰化鉀溶液，混勻，15 min后，在510 nm處測(cè)吸光度。

1.2.2 降酚菌株的分離與純化 配制100 mL的富集培養(yǎng)基，高壓滅菌后加入終濃度0.002 5 g·L-1的兩性霉素溶液和終濃度1 g·L-1苯酚溶液混勻，挑取采集的污泥樣品接種到培養(yǎng)基中，置于28 ℃，180 r·min-1的搖床上振蕩培養(yǎng)2 d。將富集培養(yǎng)液梯度稀釋101，102，103，104，105倍，然后分別取104和105倍稀釋液100 μL 接種到苯酚濃度（m/V）為1.5，2.0，2.5 ，3.0 g·L-1無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。挑取無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的不同形態(tài)的單菌落，接種于富集培養(yǎng)基中，于28 ℃，180 r·min-1的搖床上振蕩培養(yǎng)16 h后，按照5%的接種量接種于苯酚濃度為1 g·L-1的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，并且按照同樣的方法，用水代替菌液作陰性對(duì)照，置于28 ℃，180 r·min-1的搖床上培養(yǎng)。然后在24 h時(shí)使用4-氨基安替比林分光光度法測(cè)定苯酚濃度，計(jì)算苯酚降解率，篩選出苯酚降解率高的菌株用于后續(xù)試驗(yàn)。

苯酚降解率=（未接菌前培養(yǎng)液苯酚量-培養(yǎng)結(jié)束培養(yǎng)液殘余苯酚量）/未接菌前培養(yǎng)液苯酚量×100%

1.2.3 降酚菌株的分子和形態(tài)特征鑒定 取1 mL菌株培養(yǎng)液，10 000 r·min-1，離心1 min，盡量吸掉上清液，根據(jù)細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取菌株基因組DNA。16S rDNA采用細(xì)菌通用引物27F（5-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3）及1492R （5-GGTTACCTT GTTACGACTT-3）進(jìn)行擴(kuò)增，PCR體系（25 μL）：2.5 μL 10×buffer，2 μL dNTP mix（2.5 mmol·L-1），0.5 μL 27F（10 μmol·L-1），0.5 μL 1492R（10 μmol·L-1），3 μL 細(xì)菌基因組DNA，水16 μL，0.5 μL Taq DNA聚合酶。PCR程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由北京華大基因有限公司進(jìn)行純化測(cè)序。然后，通過(guò)BLAST與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)序列進(jìn)行比對(duì)，并通過(guò)MEGA 5.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

菌體形態(tài)特征鑒定通過(guò)采用結(jié)晶紫和碘液先后染色，乙醇脫色，番紅復(fù)染的方法對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色，采用Olympus DP71高倍顯微鏡觀察菌體結(jié)構(gòu)特征。

1.2.4 降酚菌株降解特性的優(yōu)化 試驗(yàn)以苯酚降解率為響應(yīng)目標(biāo)，采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取溫度、pH值、搖床轉(zhuǎn)數(shù)、初始接菌量、苯酚初始濃度、葡萄糖、甲醇、乙醇、酵母膏、硫酸銨、硫酸鋅、硫酸銅、硫酸錳、氯化鐵、氯化鈉、硫酸鎂16個(gè)模擬工業(yè)廢水中對(duì)菌株降解苯酚具有影響的相關(guān)因素進(jìn)行設(shè)計(jì)，通過(guò)回歸分析，比較各個(gè)因素兩水平的差異與整體的差異來(lái)確定因素的顯著性，從而得到對(duì)菌株降解苯酚有顯著影響的因素，再用正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化菌株最佳降解條件，并進(jìn)行驗(yàn)證。用Minitab 15軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.2.5 不同濃度苯酚對(duì)降酚菌株生長(zhǎng)的影響 將純化的菌株再次接種到以苯酚為唯一碳源，濃度分別為1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2.0，2.1，2.2，2.3，2.4，

2.5 g·L-1的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，以確定菌株耐受的最高苯酚濃度。

1.2.6 粗酶液的提取 將篩選出的菌株接種到富集培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后接種到以1 g·L-1苯酚為唯一碳源的液體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期菌液10 mL，4 ℃，12 000 r·min-1高速離心5 min，收集菌體，上清液留取待用，菌體用pH值為6.8磷酸鹽緩沖液清洗2次，然后用磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞，加入終濃度為10 mg·mL-1的蛋白酶K，用SCIENTZ98-III杯式超聲破碎儀破碎細(xì)胞， 超聲破碎30 s，間隔25 s，連續(xù)超聲45 min，4 ℃，12 000 r·min-1離心20 min，收集上清液即為粗酶液[13]。

1.2.7 酶活的測(cè)定 （1）苯酚羥化酶活力測(cè)定。苯酚羥化酶活力嚴(yán)格依賴于NADPH的存在，NADPH在340 nm處有吸收，通過(guò)在波長(zhǎng)340 nm處測(cè)定NADPH的減少速度來(lái)表示。一個(gè)單位（U）的苯酚羥化酶活性被定義為每毫克蛋白每分鐘氧化1 μmol NADPH所需的酶量。酶活測(cè)定參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行檢測(cè)。（2）鄰苯二酚-1， 2-加氧酶（C12O）活力測(cè)定。以單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)產(chǎn)物（粘糠酸）在260 nm處吸光度變化表示。（3）鄰苯二酚-2， 3 加氧酶活力測(cè)定。以單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)產(chǎn)物（2-羥基粘糠酸半醛）在375 nm處吸光度變化表示。一個(gè)單位（U）的鄰苯二酚1，2（或2，3）雙加氧酶活性被定義為每毫克蛋白每分鐘產(chǎn)生1 μmol黏糠酸（或2-羥基黏糠酸半醛）所需的酶量[15]。雙加氧酶活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行檢測(cè)，以磷酸鹽緩沖液為參比?？偟鞍缀坑肂radford 法測(cè)定[17]。酶的比活力以每毫克的蛋白質(zhì)中所含酶的活力單位數(shù)計(jì)算。

酶的比活力=（ （ΔAs-ΔAb）·V）/（ [ε·d·ΔT·mg （protein）]） 式中，ΔAs表示樣品吸光度的變化值；ΔAb表示空白對(duì)照吸光度的變化值；V表示反應(yīng)體系總體積；ε表示摩爾吸光系數(shù)；ΔT表示反應(yīng)時(shí)間。ε340 = 6 220 L·（mol-1·cm-1），ε260 = 16 800 L·（mol-1·cm-1），ε375 = 44 700 L·（mol-1·cm-1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解苯酚細(xì)菌的篩選和鑒定

經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩，獲得13種苯酚降解細(xì)菌，分別編號(hào)B1～B13。將13株菌進(jìn)行苯酚降解率測(cè)定，得到1株降解率最高的菌株，菌株在苯酚濃度為1 g·L-1時(shí)的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，經(jīng)28 ℃，180 r·min-1培養(yǎng)24 h，可使苯酚降解率達(dá)到47.9%。提取菌株基因組DNA后，通過(guò)細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，得到長(zhǎng)度為1 447 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，序列（GenBank登錄號(hào)：MG738215.1）經(jīng)BLAST與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的序列比對(duì)分析，結(jié)果表明，它與Bacillus sp. KT981880.1序列有99%相似性，初步鑒定該菌株為Bacillus屬細(xì)菌，命名為Bacillus sp. B10。菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖1所示。經(jīng)革蘭氏染色確定該菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌，菌落形態(tài)呈桿狀，并且有芽孢生成，結(jié)果如圖2所示。

2.2 Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選降解苯酚重要因素

采用試驗(yàn)次數(shù)N=16的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)模擬工業(yè)廢水中影響菌株Bacillus sp. B10苯酚降解率的16個(gè)因素進(jìn)行研究，每組重復(fù)3次。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表1所示，各因素主效應(yīng)分析如表2所示，應(yīng)用Minitab軟件分析模型的P=0.046，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果可信。苯酚降解率回歸分析復(fù)相關(guān)系數(shù)為0.980 2，調(diào)整后為0.874 6，說(shuō)明數(shù)據(jù)對(duì)模型的擬合度較好。根據(jù)主效應(yīng)分析結(jié)果，將置信度高于90%的因素作為進(jìn)一步優(yōu)化的因素，可知影響B(tài)10菌降解苯酚的顯著性因素依次為酵母膏、初始接菌量、硫酸鎂、培養(yǎng)溫度和乙醇，而其他因素對(duì)菌B10的苯酚降解率沒(méi)有顯著影響。

2.3 正交優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果，本試驗(yàn)選擇可信度大于90%以上的因素作為重要因素，因此選擇酵母膏（L）、初始接菌量（D）、硫酸鎂（T）、溫度（A）和乙（J）5個(gè)因素，進(jìn)行5因素4水平正交設(shè)計(jì)，選用L16（45 ）正交試驗(yàn)表進(jìn)行。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表及結(jié)果如表3所示。方差分析如表4所示。

由極差分析結(jié)果可知，對(duì)B10菌苯酚降解率影響的因素次序?yàn)橐掖?gt;酵母膏>初始接菌量>溫度>硫酸鎂；方差分析結(jié)果表明，酵母膏、乙醇和初始接菌量為顯著影響因素，溫度和硫酸鎂影響不顯著。因此，可確定影響B(tài)10菌苯酚降解率的最佳條件為：酵母膏10 g·L-1，乙醇4 g·L-1，初始接菌量2.5%，培養(yǎng)溫度30 ℃，硫酸鎂1 g·L-1。

2.4 不同濃度苯酚對(duì)降酚菌株生長(zhǎng)的影響

將菌株分別接種于以1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，

2.0，2.1，2.2，2.3，2.4，2.5 g·L-1苯酚為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d后觀察發(fā)現(xiàn)，該菌株在苯酚濃度為2.3 g·L-1及其以下濃度的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上均有菌落生長(zhǎng)，而在苯酚濃度為2.4～2.5 g·L-1上均無(wú)菌落生長(zhǎng)。說(shuō)明該菌株最大苯酚耐受濃度為2.3 g·L-1。

2.5 菌株苯酚代謝途徑分析

通過(guò)測(cè)定B10菌株粗酶液中苯酚羥化酶、鄰苯二酚1，2-加氧酶和鄰苯二酚2，3-加氧酶的活性，初步判斷該菌株降解苯酚途徑。在以苯酚為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中，菌體粗酶液中苯酚羥化酶的比活力為（0.030 9±0.017 5）U·mg-1蛋白質(zhì)，未破碎細(xì)胞上清液中苯酚羥化酶比活力為（0.093 8±0.002 1）U·mg-1，表明該酶可能為胞外酶，但尚有待進(jìn)一步驗(yàn)證。鄰苯二酚1， 2-加氧酶的比活力為（0.062 6±0.011 7）U·mg-1蛋白質(zhì)，而鄰苯二酚2， 3-加氧酶的活性未檢測(cè)到，因此，推斷該菌株降解苯酚以鄰位開(kāi)環(huán)降解為主。菌體破碎后上清液中鄰苯二酚1， 2-雙加氧酶的活性遠(yuǎn)高于未破碎菌體上清液中酶活性，表明該酶為胞內(nèi)酶。