急性單核細(xì)胞白血病相關(guān)抗原基因MLAA-22全長(zhǎng)的克隆及生物信息學(xué)分析

篩選具有臨床應(yīng)用價(jià)值的腫瘤抗原基因是開展免疫治療的前提，也是腫瘤免疫治療研究中的關(guān)鍵問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)組前期構(gòu)建了具有單核細(xì)胞分化特點(diǎn)的人U937細(xì)胞定向克隆cDNA表達(dá)文庫(kù)，并采用急性單核細(xì)胞白血病患者的混合血清對(duì)所建文庫(kù)進(jìn)行免疫篩選,獲得了急性單核細(xì)胞白血病多個(gè)腫瘤相關(guān)抗原[1]。MLAA-22是其中具有代表性的基因之一，由于從cDNA文庫(kù)中篩選得到的基因一般都是編碼基因的部分片段，前期僅采用電子克隆的方法拼接獲得了cDNA全長(zhǎng)[2]。本研究以建庫(kù)所用人U937細(xì)胞系為對(duì)象，應(yīng)用RACE法克隆MLAA-22基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并對(duì)MLAA-22序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)，為進(jìn)行后期的功能研究提供了可靠的數(shù)據(jù)平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株U937購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。細(xì)菌菌株：大腸桿菌DH5α購(gòu)自TIANGEN生物公司。質(zhì)粒：pMD-18T載體，購(gòu)自Takara公司。T4 DNA連接酶、Taq DNA Polymerase、High Fidelity PrimeScript RT-PCR、DNA凝膠回收試劑盒、High Fidelity PrimeScript RT-PCR Kit、5'-Full RACE Kit、3'-Full RACE Kit均購(gòu)自Takara公司；質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖匈?gòu)自TIANGEN公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) U937細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%的胎生血清，100 μ/mL青霉素和100 μ/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為37 ℃，5%CO2，飽和濕度。定期觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2 RACE實(shí)驗(yàn) 5'-Full RACE：根據(jù)從cDNA文庫(kù)中已得到的MLAA-22基因(AY288965)的cDNA序列，使用引物設(shè)計(jì)專用軟件分別設(shè)計(jì)其下游特異性引物GSP2(外側(cè)引物)：5'-ACTGAGCTTTGGCAGCCGATACAAT-3'，以及下游特異性引物GSP3(內(nèi)側(cè)引物)： 5'-CTCAATAAGGCAGTTTCGGTGGTAT-3'；此引物由Takara公司合成。按廠家提供的試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行MLAA-22基因的5'-Full RACE實(shí)驗(yàn)，以擴(kuò)增其cDNA的5'端未知序列。

3'-Full RACE：根據(jù)從cDNA文庫(kù)中已得到的MLAA-22基因的cDNA序列，使用引物設(shè)計(jì)專用軟件分別設(shè)計(jì)其上游特異性引物GSP1(外側(cè)引物)：5'-ACCTTAACTTGGTGCTACCCTGTC-3'，以及上游特異性引物GSP2(內(nèi)側(cè)引物)： 5'-TGGTTGCCCAGGTAATCAAAGA-3'；此引物由Takara公司合成。按廠家提供的試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行MLAA-22基因的3'-Full RACE實(shí)驗(yàn)，以擴(kuò)增其cDNA的3'端未知序列。測(cè)序：將5'RACE及3' RACE擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用DNA凝膠回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物直接克隆入pMD-18T載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，擴(kuò)增，分別選取3個(gè)陽(yáng)性克隆，送Takara公司測(cè)序。

1.2.3 MLAA-22基因全長(zhǎng)cDNA序列的克隆 為驗(yàn)證新得到的MLAA-22基因全長(zhǎng)cDNA序列，根據(jù)從上步RACE實(shí)驗(yàn)中已得到的新序列，使用引物設(shè)計(jì)專用軟件分別設(shè)計(jì)MLAA-22上游特異性引物：5'-AAGAAAGAATATCAGGAGCA-3，以及下游特異性引物： 5'-ACAGCAGAAAAAATAGGCAC-3'；以U937細(xì)胞系為研究對(duì)象，按廠家提供的試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行MLAA-22基因的RT-PCR實(shí)驗(yàn)，擴(kuò)增MLAA-22基因全長(zhǎng)cDNA序列。測(cè)序：將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物用DNA凝膠回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物直接克隆入pMD-18T載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，擴(kuò)增，分別選取3個(gè)陽(yáng)性克隆，送Takara公司測(cè)序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)MEDLINE網(wǎng)檢索MLAA222基因的相關(guān)信息,包括同源比對(duì)、染色體的定位、核酸序列比對(duì)、結(jié)構(gòu)功能域分析、基序(motif)分析等,對(duì)其理化性質(zhì)、基本功能和抗原性做大致了解。

2 結(jié)果

2.1 5'-Full RACE實(shí)驗(yàn)結(jié)果

5'RACE 擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收產(chǎn)物純化后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，可見一大小約550 bp左右的清晰條帶片段(圖1)。

1，3均為5'RACE產(chǎn)物；2為marker。圖1 5'RACE產(chǎn)物電泳圖

TA克隆后通過(guò)PCR鑒定陽(yáng)性克隆送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果結(jié)果經(jīng)過(guò)BLAST比對(duì)除去載體序列及與原MLAA-22重疊的部分后，在5'端延伸了424 bp。

2.2 3'-Full RACE實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3'RACE擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收產(chǎn)物純化后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，可見一大小約800 bp左右的清晰條帶(圖2)。

1為marker；2，3均為3'RACE膠回收產(chǎn)物。圖2 3'RACE產(chǎn)物電泳圖

經(jīng)TA克隆后通過(guò)PCR鑒定陽(yáng)性克隆送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)BLAST比對(duì)除去載體序列及與原MLAA-22重疊的部分后，在5'端延伸了606 bp。

2.3 MLAA-22基因全長(zhǎng)cDNA序列的克隆

經(jīng)3'及5'RACE擴(kuò)增后得到MLAA-22 cDNA全長(zhǎng)為3070 bp，為驗(yàn)證全長(zhǎng)序列的可靠性，對(duì)全長(zhǎng)序列分3段擴(kuò)增，包含重疊部分，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后分別可見大小約2 kb、400 bp及600 bp的片段(圖3)，TA克隆測(cè)序后經(jīng)過(guò)拼接除去重疊部分后序列與RACE后得到的序列高度同源，驗(yàn)證了MLAA-22 cDNA的可靠性。全長(zhǎng)擴(kuò)增產(chǎn)物400 bp產(chǎn)物凝膠電泳圖(圖3b)；全長(zhǎng)擴(kuò)增產(chǎn)物600 bp產(chǎn)物凝膠電泳圖(圖3c)。

1為擴(kuò)增產(chǎn)物，2為marker；a為MLAA-22全長(zhǎng)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；b為全長(zhǎng)擴(kuò)增產(chǎn)物400 bp電泳圖；c為全長(zhǎng)擴(kuò)增產(chǎn)物600 bp產(chǎn)物凝膠電泳圖。圖3 MLAA-22全長(zhǎng)擴(kuò)增電泳圖

2.4 MLAA-22的生物信息學(xué)分析

2.4.1 基于核苷酸序列的分析結(jié)果 編碼區(qū)序列及所編碼的蛋白：新獲MLAA-22的全長(zhǎng)cDNA序列包含3067 bp核苷酸，用NCBI網(wǎng)站(www.ncbi.nlm.nib.gov)的ORF Finder軟件分析，其有完整的ORF框，編碼1個(gè)含有701個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。采用BLAST與 genome比對(duì)結(jié)果：經(jīng)過(guò)與最新公布的人類基因組序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，MLAA-22定位于17q11.2基因包含12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子。 序列同源性分析：新獲MLAA-22的全長(zhǎng)cDNA序列包含3067bp，用NCBI的Blast程序比對(duì)人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)后發(fā)現(xiàn)MLAA-22定位于17q11.2，基因包含12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)其有完整的ORF框，編碼1個(gè)含有701個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。在17q11.2基因座位上還存在人類假定基因KIAA0100及人乳腺癌過(guò)表達(dá)基因BCOX1(breast cancer overexpressed gene 1，BCOX1)(GenBank:AY943906)。人假定基因KIAA0100 mRNA全長(zhǎng)7456 bp，預(yù)測(cè)的編碼蛋白序號(hào)為L(zhǎng)oc9703，有關(guān)KIAA0100基因及蛋白的功能目前尚不明確。

2.4.2 基于氨基酸序列的生物信息學(xué)分析結(jié)果 MLAA-22的理化性質(zhì)：氨基酸數(shù)目：701；分子量：80529.7 Dolton；理論等電點(diǎn)PI：6.09；分子式：C3532H5658N1010O1079S31；原子總數(shù)：11310。

不穩(wěn)定系數(shù)：MLAA-22的不穩(wěn)定系數(shù)是52.18，當(dāng)1個(gè)蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)>40時(shí)，提示該蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，因此提示MLAA-22在體內(nèi)不穩(wěn)定。

蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果：通過(guò)Peptidecutter軟件預(yù)測(cè)了對(duì)MLAA-22有剪切作用的酶及其可能的剪切位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tobacco etch virus protease、Thrombin、Iodosobenzoic acid GranzymeB、Hydroxylamine、Factor Xa、Enterokinase、BNPS-Skatole及Caspase2-10對(duì)MLAA-22均無(wú)剪切作用。

抗原模擬表位預(yù)測(cè)結(jié)果：HLA_Bind和SYFPEITHI程序?qū)LAA-22 MHC Ⅰ及MHC Ⅱ限制性抗原肽預(yù)測(cè)結(jié)果如下：HLA Peptide Binding Predictions 程序?qū)LAA-22MHC-I限制性抗原9肽預(yù)測(cè)結(jié)果(表1)。

表1 MLAA-22和HLA-A_0201A結(jié)合的九肽預(yù)測(cè)結(jié)果

SYFPEITHI程序?qū)LAA-22 MHC Ⅱ分子限制性抗原15肽預(yù)測(cè)結(jié)果(表2)。

表2 MLAA-22和HLA-DRB1*0301(DR17)結(jié)合的15肽預(yù)測(cè)結(jié)果

3 討論

腫瘤免疫治療的關(guān)鍵和先決條件就是要尋找腫瘤特異性抗原。MLAA-22是實(shí)驗(yàn)組前期采用SEREX方法篩選出的具有代表性的M5腫瘤相關(guān)抗原基因之一[1]，采用PCR在多種白血病細(xì)胞系中檢測(cè)MLAA-22的表達(dá)發(fā)現(xiàn)mRNA表達(dá)均有不同程度升高，尤以急性單核細(xì)胞白血病最為顯著[3]。由于從cDNA文庫(kù)中篩選得到的基因一般都是編碼基因的部分片段，前期通過(guò)硅片克隆的方法拼接所得MLAA-22cDNA全長(zhǎng)約2Kb[2]，但由于生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)雜性，許多分析軟件的輸結(jié)果存在較大的偏差，因而對(duì)計(jì)算機(jī)模擬的結(jié)果尚需要回到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步證實(shí)，要進(jìn)行新基因的生物學(xué)功能和醫(yī)學(xué)意義的研究，必須首先克隆獲得編碼基因的cDNA全長(zhǎng)序列。 本研究采用基于PCR的cDNA末端快速擴(kuò)增法RACE技術(shù)，在原有MLAA-22 cDNA序列的基礎(chǔ)上分別在3'及5'端延長(zhǎng)了424bp和609bp，經(jīng)過(guò)拼接去除重疊部分序列，新獲得MLAA-22全長(zhǎng)3067bp，針對(duì)新獲得的全長(zhǎng)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證了cDNA全長(zhǎng)的可靠性。 隨后在此序列基礎(chǔ)上對(duì)MLAA-22的結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)行了一系列的生物信息學(xué)分析，首先采用ORF Finder軟件對(duì)全長(zhǎng)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其有完整的ORF框，編碼1個(gè)含有701個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。經(jīng)過(guò)NCBI BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)MLAA-22定位于17號(hào)染色體，在此基因座位上存在人類假定基因KIAA0100及人乳腺癌過(guò)表達(dá)基因BCOX1(GenBank：AY943906)。人假定基因KIAA0100 mRNA全長(zhǎng)7456bp，預(yù)測(cè)的編碼蛋白序號(hào)為L(zhǎng)oc9703，有關(guān)KIAA0100基因及蛋白的功能目前尚不明確。Song等[4]首次采用SAGE(serial analysis of gene expression，SAGE)技術(shù)對(duì)乳腺癌相關(guān)基因進(jìn)行研究，獲得了BCOX1(breast cancer overexpressed gene 1)基因，深入的研究發(fā)現(xiàn)此基因在乳腺癌組織中高表達(dá)而在正常的乳腺上皮組織中并不表達(dá)，且表達(dá)水平與疾病的進(jìn)展密切相關(guān)。Liu等[5]檢測(cè)了491例的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者腫瘤組織及癌旁組織中BCOX1mRNA表達(dá)發(fā)現(xiàn)59.5%的患者高表達(dá)BCOX1，且BCOX1高表達(dá)與患者的OS呈負(fù)相關(guān)，可能是乳腺癌治療的潛在靶點(diǎn)。近期一項(xiàng)關(guān)于前列腺癌的研究[6]也發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-195的表達(dá)可導(dǎo)致BCOX1表達(dá)升高以致前列腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移，因此BCOX1可能與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。 通過(guò)BLAST發(fā)現(xiàn)BCOX1與KIAA0100基因二者高度同源，但同與KIAA0100基因高度同源的BCOX1與MLAA-22卻沒(méi)有任何同源性，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)BCOX1的編碼區(qū)(CDS)與MLAA-22的CDS在基因組序列上相距大于15kb的距離，所以二者序列無(wú)同源性也就得到了合理的解釋。這一現(xiàn)象也提示我們：KIAA0100基因?qū)嶋H上可能包含多種功能基因，但詳情未知。 通過(guò)BLAST比對(duì)我們發(fā)現(xiàn)：MLAA-22全長(zhǎng)序列的350-3070 bp與KIAA0100 mRNA完全匹配，1-349 bp與KIAA0100 mRNA不匹配，這一段序列雖不屬於ORF，但它屬于MLAA-22的5'UTR(untranslated regions，UTR)。選擇性剪接(alternative splicing，AS)又稱可變剪接，是指從1個(gè)mRNA前體通過(guò)選擇不同的剪接位點(diǎn)進(jìn)行不同的剪接方式而產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體的過(guò)程。它是調(diào)節(jié)基因表達(dá)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)組多樣性的重要機(jī)制,也是導(dǎo)致人類基因和蛋白質(zhì)數(shù)量較大差異的重要原因。在胚胎干細(xì)胞中AS 對(duì)細(xì)胞多態(tài)性也有重要作用[7]。據(jù)估計(jì)大約有35%～65%的人類基因具有可變剪接特性，主要涉及參與信號(hào)傳導(dǎo)和表達(dá)調(diào)節(jié)等復(fù)雜過(guò)程，如受體、信號(hào)傳導(dǎo)通路(凋亡)及轉(zhuǎn)錄因子等基因[8-9]。如CD44表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后都密切相關(guān)，臨床資料顯示CD44 的剪接變異體(CD44v)在各種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，且相同的腫瘤中會(huì)有多種CD44v 的協(xié)同參與[10]。由此推測(cè)MLAA-22可能在5'UTR區(qū)發(fā)生了選擇性剪接，參與了MLAA-22表達(dá)的調(diào)控，后期需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

在MLAA-22酶切位點(diǎn)分析結(jié)果提示：MLAA-22存在大量的Proteinase K的酶切位點(diǎn)，蛋白激酶催化蛋白質(zhì)磷酸化從而改變其活性，蛋白激酶是細(xì)胞信號(hào)通道中起化學(xué)修飾作用的成員，參與多種細(xì)胞功能諸如

細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂、分化、細(xì)胞間相互作用、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用等調(diào)控。這從1個(gè)角度提示MLAA-22編碼的蛋白可能在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化中具有一定的作用。 MLAA-22 cDNA全長(zhǎng)3067 bp，染色體定位于17q11.2。綜合對(duì)于MLAA-22的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果，結(jié)合MLAA-22來(lái)源于急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞U937的cDNA文庫(kù)，且在M5中特異性高表達(dá)等現(xiàn)象推測(cè)MLAA-22可能和急性單核細(xì)胞白血病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，值得進(jìn)一步深入研究。