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    脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植對輸血相關(guān)急性肺損傷大鼠巨噬細(xì)胞表面TLR4及CD40 的影響

    2018-12-27 01:48:28王景順
    中國老年學(xué)雜志 2018年24期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞液肺泡引物

    王景順

    (漯河市中心醫(yī)院 漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一附屬醫(yī)院輸血科,河南 漯河 462000)

    輸血相關(guān)急性肺損傷(TRALI)是指經(jīng)過輸血或血液相關(guān)制品后引起的肺組織急性損傷,發(fā)病急,死亡率高,可達(dá)14%〔1~6〕。TRALI多表現(xiàn)為呼吸衰竭及肺水腫,因輸血引起的肺水腫為非心源性。TRALI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,至今尚未明確,已有研究證實(shí),巨噬細(xì)胞激活及巨噬細(xì)胞表面Toll樣受體(TLR)4、CD40 表達(dá)的改變是 TRALI 發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)〔7~9〕。干細(xì)胞是一類能夠在特定條件下分化成各種組織器官的細(xì)胞〔10~14〕,大量研究將干細(xì)胞移植運(yùn)用于各種疾病的治療,已經(jīng)取得了令人矚目的進(jìn)展〔15~23〕,包括對TRALI的改善及治療。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADMSCs)不僅來源廣泛,而且具有較強(qiáng)的分化及增殖能力〔24~32〕,成為繼骨髓干細(xì)胞之后的又一熱點(diǎn)。本研究旨在探究ADMSCs對巨噬細(xì)胞表面TLR4、CD40 的影響。

    1 材料與方法

    1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只雄性SD大鼠,4~5周齡,體重(240±20)g,由河南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物研究中心提供。

    1.2主要材料及來源 脂多糖(LPS,美國Sigma-Aldrich)、腫瘤壞死因子(TNF)-α,白細(xì)胞介素(IL)-1β及缺血預(yù)適應(yīng)上調(diào)蛋白(MIP)-2 的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒(USA R&D)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、8-羥基脫氧鳥嘌呤氯甲基苯甲酰氨(OhdG)蛋白測定試劑盒(南京邁博生物科技有限公司)、氯甲基苯甲酰氨(CM-DiI)細(xì)胞標(biāo)記液(美國Molecular Probes公司)、顯微鏡(Leica 公司)、流式細(xì)胞儀(美國Coulter公司產(chǎn)品)、離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)

    1.3體外培養(yǎng)ADMSCs 大鼠腹腔注射麻醉,固定,手術(shù)刀切開皮膚,取5 g左右大鼠附睪處脂肪組織置于培養(yǎng)皿中,向培養(yǎng)皿中加入將200 U/ml青霉素及200 U/ml鏈霉素,將磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后的脂肪組織剪成乳糜樣顆粒,首先加入0.25%胰蛋白酶除去結(jié)締組織,然后加入適量的Ⅰ型膠原酶去除脂肪消化,60 min后取出培養(yǎng)皿,棄上清液,剩余的懸濁液經(jīng)濾網(wǎng)過濾后收集于離心管中,1 500 r/min離心10 min,棄上清,加入PBS再次沖洗2遍,再離心,棄上清,上訴步驟重復(fù)3次后加入完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后換新的培養(yǎng)基,棄上清同時(shí)將未貼壁的細(xì)胞一同棄去,之后每隔1 d以同樣的方法更換一次培養(yǎng)基,同時(shí)察看細(xì)胞的生長情況〔33〕。

    1.4大鼠TRALI模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、TRALI 組及移植組各10只。經(jīng)腹腔注射2 mg/kg LPS,注射完畢2 h后麻醉,經(jīng)股靜脈抽約1 ml血液,再注入等量人血漿。移植組小鼠采用同上述方法,注射完血漿后注入1 ml ADMSCs混懸液;而假手術(shù)組采用TRALI組同樣的方法后注射1 ml生理鹽水〔34〕。

    1.5熒光顯微鏡觀察CM-Dil標(biāo)記的ADMSCs存活及分布情況 移植組大鼠處死后取少許肺組織,加入適量的胰酶及乙二胺四乙酸進(jìn)行細(xì)胞消化,經(jīng)過一定時(shí)間后加入含血培養(yǎng)基停止消化。吸取少量細(xì)胞液于離心管中離心,隨后反復(fù)沖洗后加入適量CM-DiI細(xì)胞標(biāo)記液,用膠頭滴管反復(fù)吹打細(xì)胞液使細(xì)胞與標(biāo)記液充分接觸,標(biāo)記完畢將其置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)孵育,20 min后取出細(xì)胞液再次離心、洗滌后,加入少量臺盼藍(lán)染色,計(jì)數(shù),將已標(biāo)記CM-DiI的ADMSCs繼續(xù)培養(yǎng),在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長及形態(tài)變化。

    1.6ELISA檢測血清及肺組織TNF-α、IL-1β及MIP-2 的含量 分別抽取等量血液,然后處死大鼠,取肺組織消化離心后制成細(xì)胞液備用。分別從各組中吸取少量的血液及細(xì)胞液加入到板條空白孔中,做好標(biāo)記,用封板膠紙進(jìn)行封閉后置于特定條件下培養(yǎng),90 min后取出,將各板孔反復(fù)沖洗,然后加入等劑量生物素化抗體,再次封孔培養(yǎng)1 h,取出,反復(fù)洗滌,加入等量的酶結(jié)合物工作液在上述相同條件下孵育,30 min后洗滌,加入顯色液30 min反復(fù)沖洗,加入終止液使反應(yīng)停止,置于酶標(biāo)儀上測定,TNF-α、IL-1β及MIP-2 均為已知消光系數(shù)的化合物。

    1.7實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測大鼠肺組織TLR4、CD40、核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB基因相對表達(dá)量 肺組織加入適量Trizol提取總RNA,按照Fermentas 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書合成第一條cDNA,依此為模板逆轉(zhuǎn)錄,然后對TLR4、CD40、NF-κB基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,分別測定TLR4、CD40、NF-κB基因的表達(dá)量。TLR4引物序列:上游引物5′-GAAATGGAGGCACCCCTTC-3′,下游引物5′-TGGATACGTTTCCTTATAAG-3′,反應(yīng)產(chǎn)物為548 bp。CD40引物序列:上游引物5′-CTTCTTCCGACCGTGACATGC-3′,下游引物5′-ATGGTTCGTCTGCCTCTGCAG-3′,擴(kuò)增后 DNA片段長330 bp。NF-κB引物序列:上游引物5′-ATCTGTTTCCCCTCATCTTTCC-3′,下游引物5′-TGGGTGCGTCTTAGTGGTATCT-3′,產(chǎn)物長度217 bp。β-actin引物序列:上游引物5′-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3′,下游引物5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3′,反應(yīng)產(chǎn)物為300 bp。TLR4、CD40、NF-κB產(chǎn)物與β-actin產(chǎn)物光密度積分的比值作為TLR4、CD40、NF-κB mRNA的表達(dá)量。

    1.8外周血巨噬細(xì)胞檢測TLR4、CD40、NF-κB的mRNA 表達(dá)量 經(jīng)離心等相關(guān)操作后從大鼠血液提取出巨噬細(xì)胞,并提取總RNA,按照試劑說明書合成cDNA,并以此為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,對 TLR4、NF-κB、CD40 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,計(jì)算mRNA 含量,整個(gè)操作按照相關(guān)說明進(jìn)行。

    1.9采用放射免疫沉淀試劑盒檢測SOD、GSH、MDA、8-OhdG 含量 肺組織加入生理鹽水制成勻漿,分別取出少量勻漿進(jìn)行離心,取上清液用于SOD、GSH、MDA、8-OhdG 含量測定,整個(gè)操作均按照試劑說明進(jìn)行。

    1.10采用蘇木素-伊紅(HE)染色觀察小鼠肺組織病理變化及計(jì)算濕干比 取雙側(cè)肺組織加10%甲醛固定24 h后,用石蠟包埋,切片(切片厚度應(yīng)均勻),HE染色,將切片封固及烤干后放在顯微鏡下觀察。取肺組織,置于錫箔紙上,將錫箔紙的質(zhì)量設(shè)定為W0,將放有肺組織的錫箔紙一起稱量,質(zhì)量設(shè)定為W1,肺組織濕重為W1-W0。烘干72 h后取出再次稱重,得W2,組織干重為W2-W0,組織濕重與干重的比值即為濕干比。

    1.11統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

    2 結(jié) 果

    2.1ADMSCs存活及分布情況 熒光顯微鏡下可見經(jīng)過標(biāo)記及臺盼藍(lán)染色后的細(xì)胞生長良好,經(jīng)過標(biāo)記的細(xì)胞顯紅色熒光,陽性標(biāo)記率達(dá)98%以上。細(xì)胞形態(tài)呈梭形,形態(tài)良好,而早期細(xì)胞內(nèi)含有較多的熒光顆粒,細(xì)胞核卻不被染色,見圖1。

    圖1 CM-DiI標(biāo)記的ADMSCs(×200)

    2.2各組血清及肺組織TNF-α、IL-1β及MIP-2含量 與假手術(shù)組相比,TRALI 組血清和肺組織TNF-α、IL-1β及MIP-2濃度明顯增高(P<0.05)。與TRALI 組相比,移植組血清和肺組織TNF-α、IL-1β及MIP-2含量顯著降低(P<0.05)。見表1。

    表1 各組血清及肺組織TNF-α、IL-1β及MIP-2含量

    與假手術(shù)組比較:1)P<0.05;與TRALI組比較:2)P<0.05;下表同

    2.3各組肺組織TLR4、CD40、NF-κB mRNA相對表達(dá)量 與假手術(shù)組相比,TRALI 組肺組織TLR4、CD40、NF-κB mRNA 表達(dá)量均顯著增高(P<0.05);而與TRALI 組相比,移植組TLR4、CD40、NF-κB mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見表2、圖2。

    表2 各組肺組織TLR4、CD40、NF-κB mRNA表達(dá)量比較

    圖2 各組肺組織TLR4、CD40、NF-κB mRNA相對表達(dá)量

    2.4各組外周血巨噬細(xì)胞中TLR4、CD40、NF-κB mRNA表達(dá)量 與假手術(shù)組比較,TRALI 組巨噬細(xì)胞中TLR4、CD40、NF-κB mRNA 表達(dá)量顯著增高(P<0.05);與TRALI 組相比,移植組TLR4、CD40、NF-κB mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見表3、圖3。

    表3 各組外周血巨噬細(xì)胞中TLR4、CD40、NF-κB表達(dá)量

    圖3 各組外周血巨噬細(xì)胞中TLR4、CD40、NF-κB mRNA的表達(dá)

    2.5肺組織SOD、GSH、MDA、8-OhdG含量 TRALI組肺組織SOD、GSH含量顯著低于假手術(shù)組,MDA、8-OhdG 含量顯著高于假手術(shù)組(P<0.05);移植組SOD、GSH含量顯著高于TRALI 組,MDA、8-OhdG含量顯著低于TRALI 組(P<0.05)。見表4。

    表4 各組肺組織SOD、GSH、MDA、8-OhdG 含量檢測結(jié)果

    2.6各組肺組織病理變化 顯微鏡下假手術(shù)組肺泡結(jié)構(gòu)完整,大小較為一致,肺泡上皮細(xì)胞形態(tài)正常,肺泡間隔厚度正常,肺泡腔內(nèi)無纖維蛋白,也未見明顯出血。TRALI組肺間質(zhì)水腫、出血,炎癥反應(yīng)加重,肺泡間隔增厚、肺泡內(nèi)纖維蛋白浸潤、肺泡內(nèi)出血、支氣管壁增厚。移植組的各種病理變化較TRALI 組明顯好轉(zhuǎn)。見圖4。

    圖4 各組肺組織病理變化(HE,×200)

    2.7各組肺組織濕干比 TRALI組肺組織濕干比(3.96±0.49)顯著低于假手術(shù)組(5.45±0.68)和移植組(4.16±0.73;P<0.05)。

    3 討 論

    TRALI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,大量研究表明TRALI發(fā)病最可能的機(jī)制為“二次打擊”〔35~39〕。本研究采用“二次打擊”機(jī)制進(jìn)行TRALI模型制備,首先對造模小鼠腹腔注射適量LPS為TRALI發(fā)生的第1事件;注射LPS后機(jī)體立刻啟動(dòng)免疫系統(tǒng),經(jīng)過2 h后再經(jīng)尾靜脈給予人血漿為TRALI發(fā)生的第2事件。研究發(fā)現(xiàn),肺泡腔內(nèi)充滿巨噬細(xì)胞,認(rèn)為巨噬細(xì)胞是肺部炎癥反應(yīng)的一個(gè)調(diào)節(jié)閥,當(dāng)受到兩次打擊后調(diào)節(jié)閥打開,炎癥反應(yīng)被激活,通過一系列炎癥連鎖反應(yīng)最終導(dǎo)致 TRALI形成〔40〕。TLR4是巨噬細(xì)胞表面的一個(gè)受體,在第一次打擊事件中TLR4是LPS的重要受體,LPS通過與TLR4結(jié)合進(jìn)一步激活 NF-κB,進(jìn)而啟動(dòng)多種炎癥介質(zhì)表達(dá)〔41〕。除此之外,被激活后的NF-κB 還可以促進(jìn)共刺激分子CD40表達(dá),進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)〔42〕。目前已有研究表明TLR4 和 CD40的過度表達(dá)是導(dǎo)致TRALI 發(fā)病的重要環(huán)節(jié)〔43~46〕。TRALI 時(shí)大鼠體內(nèi)活化巨噬細(xì)胞表面 TLR4 及 CD40表達(dá)量顯著升高,進(jìn)而會通過一系列炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等環(huán)節(jié)造成肺損傷〔47~49〕。

    本研究提示TRALI后TLR4及CD40表達(dá)量明顯上升,誘發(fā)炎癥等一系列反應(yīng),ADMSCs移植后可減輕肺損傷程度。

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