過表達(dá)endophilin A2減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥大*

王昕秋悅， 湛青平， 劉 蕓

(廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室, 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心機(jī)能實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 511436)

心肌肥大(myocardial hypertrophy)是心臟對持續(xù)增加的心臟負(fù)荷的一種代償性反應(yīng)，主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞體積增大、心臟重量增加、間質(zhì)細(xì)胞增生以及心肌重構(gòu)等[1-2]。長期的心肌肥大可使心臟進(jìn)入失代償階段，出現(xiàn)心臟收縮功能和舒張功能障礙，最終導(dǎo)致心律失常和心衰。因此，深入研究心肌肥大的分子機(jī)制，尋找延緩或逆轉(zhuǎn)心肌肥大的有效靶點(diǎn)，具有十分重要的意義。

吞蛋白A2(endophilin A2，EndoA2)是一類由N端Bin/amphiphysin/Rvs(BAR)結(jié)構(gòu)域、中間可變的多聚脯氨酸富集序列和C端的SH3結(jié)構(gòu)域組成的蛋白質(zhì)，廣泛表達(dá)于真核細(xì)胞中[3]。早期研究發(fā)現(xiàn)，EndoA2可通過其C端的SH3結(jié)構(gòu)域與amphiphy-sin、 synaptojanin和dynamin等蛋白的多聚脯氨酸結(jié)構(gòu)域結(jié)合，調(diào)節(jié)突觸囊泡的內(nèi)吞[4]。因此，早期的研究主要集中在其內(nèi)吞功能，如調(diào)節(jié)表皮生長因子受體內(nèi)吞和金屬蛋白酶內(nèi)吞等[5- 6]。近年的研究資料顯示，EndoA2具有排筏的作用，可以調(diào)節(jié)其它蛋白，如ClC-3和Bax在細(xì)胞內(nèi)的亞定位，從而在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。然而，EndoA2在心肌肥大中的作用國內(nèi)外少有報(bào)道，值得進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)以SD大鼠作為主要研究對象，通過在左心室壁注射Ad-EndoA2腺病毒過表達(dá)EndoA2，探索EndoA2在異丙腎上腺素(isoprenaline，ISO)誘導(dǎo)的心肌肥大中的作用。

材 料 和 方 法

1 動物

健康SPF級SD大鼠28只，雄性，7～8周齡，體重(210±10) g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK(粵)2013-0034。飼養(yǎng)環(huán)境模擬自然晝夜條件，溫度(22±3) ℃，濕度40%～45%，自由飲水。

2 主要試劑

鹽酸異丙腎上腺素(Sigma，批號15627)；Ad-EndoA2腺病毒(上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司)；TRIzol Reagent(Invitrogen)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)；心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide, ANP)、腦鈉肽(brain natriuretic peptide, BNP)及β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain, β-MHC)的引物序列由Invitrogen公司合成；抗LC3和 P62抗體(Cell Signaling Technology)；異氟烷(北京瑞沃德公司)；其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

3 主要方法

3.1動物造模與分組 將7～8周齡的健康成年SD雄鼠28只隨機(jī)分為4組:假手術(shù)(sham)組、 Ad-EndoA2組、 ISO模型組和ISO+Ad-EndoA2組。Sham組采用5點(diǎn)注射法將磷酸緩沖鹽溶液注射到大鼠心臟左心室前壁，次日背部皮下注射生理鹽水； Ad-EndoA2組采用5點(diǎn)注射法將100 μL 1×10-6PFU/L Ad-EndoA2腺病毒注射到大鼠心臟左心室前壁，次日背部皮下注射生理鹽水; ISO模型組采用5點(diǎn)注射法將磷酸緩沖鹽溶液注射到大鼠心臟左心室前壁，次日背部皮下注射ISO(1.5 mg·kg-1·d-1); ISO+Ad-EndoA2組采用5點(diǎn)注射法將100 μL 1×10-6PFU/L Ad-EndoA2腺病毒注射到大鼠心臟左心室前壁，次日背部皮下注射ISO(1.5 mg·kg-1·d-1)。背部皮下注射ISO或生理鹽水連續(xù)7 d。給藥期間，正常飲食，自由飲水，每天記錄一次大鼠的體重。7 d后取材，除ISO+Ad-EndoA2組死亡 1 只外，其余組均全部存活。

3.2超聲影像學(xué)檢測動物心功能 大鼠持續(xù)吸入異氟烷麻醉后，固定于37 ℃恒溫加熱板上，除凈胸毛，于胸部涂少量耦合劑，使用VisualSonics的Vevo 2100高分辨小動物超聲成像系統(tǒng)(RMV250探頭)及15L8高頻率探頭Acuson Sequoia 512超聲儀(Siemens)進(jìn)行檢測。檢測時將M型取樣線置于與乳頭肌相切的位置，可獲得相應(yīng)的M型曲線。在二維超聲引導(dǎo)下，M型超聲測定大鼠左室收縮期前壁厚度(left ventricular anterior wall during systole，LVAWs)、左室收縮期后壁厚度(left ventricular posterior wall during systole，LVPWs)、左室收縮期內(nèi)徑(left ventri-cular ventricular internal diameter during systole，LVIDs)、射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)、短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)和心輸出量(cardic output，CO)。每個測定值均取5個連續(xù)完整心動周期測量取平均值。

3.3HE染色 迅速取出心臟，用4 ℃ PBS(含10% KCl)將心臟洗干凈，用4%多聚甲醛固定后，可直接用顯微鏡拍心臟大體。固定48 h后進(jìn)行石蠟包埋，隨后切成4 mm厚切片，脫蠟并使用蘇木精和伊紅染色。在普通光學(xué)顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài)。

3.4RT-qPCR 將100 mg心肌組織樣本加入1 mL TRIzol試劑，置于冰上充分研磨，經(jīng)異丙醇沉淀后獲得心肌組織總RNA；按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書方法，取500 μg總RNA在10 μL體系中逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；然后取cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，以GAPDH為內(nèi)參照，檢測ANP、BNP及β-MHC的表達(dá)。PCR擴(kuò)增條件為: 95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，循環(huán)40次；95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s。根據(jù)公式2-ΔΔCt計(jì)算ANP、BNP及β-MHC的相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

3.5Western blot實(shí)驗(yàn) 向洗凈的心臟組織中加入裂解液研磨，4 ℃、 12 000 r/min離心15 min，離心后吸取上清，BCA法測定樣品濃度。各組取樣品上樣，進(jìn)行SDS-PAGE后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜, 5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后分別敷對應(yīng) I 抗,室溫孵育1 h，再4 ℃敷育過夜，次日將PVDF膜用TBST洗后，再室溫敷育相應(yīng) II 抗1.5 h?；瘜W(xué)發(fā)光ECL顯影，曝光成像。以β-tubulin為內(nèi)參照,利用ImageJ軟件對顯影的條帶進(jìn)行灰度分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 過表達(dá)EndoA2改善ISO誘導(dǎo)的大鼠心肌肥大過程中心功能變化

超聲心動影像結(jié)果顯示，與sham組相比，ISO組的LVAWs、LVPWs、FS和EF顯著增加，LVIDs和CO則顯著下降(P<0.05)，說明大鼠心臟明顯發(fā)生了肥大，其中FS和EF顯著增加，表明心臟收縮功能屬于代償性增強(qiáng)；過表達(dá)EndoA2則可以減輕ISO誘導(dǎo)的心肌肥大，改善心功能(P<0.05)，而單獨(dú)過表達(dá)EndoA2對心功能無影響，見圖1。

Figure 1.The representative images and analysis results of echocardiographic assessment of hearts subjected to ISO. Mean±SD. n=5. *P<0.05 vs sham group; #P<0.05 vs ISO group.

2 過表達(dá)EndoA2降低ISO誘導(dǎo)的心肌肥大大鼠的心臟重量指數(shù)

ISO組大鼠的心臟重量與體重的比值(heart weight/body weight, HW/BW)及左心室重量與體重的比值(left ventricular weight/body weight, LVW/BW)較對照組顯著增加(P<0.05), ISO+Ad-EndoA2組與ISO組比較則明顯降低(P<0.05)，而單獨(dú)過表達(dá)EndoA2對心臟重量指數(shù)無影響，見圖2。

Figure 2.The analysis of heart weight/body weight ratio and left ventricle weight/body weight ratio. Mean±SD. n=5. *P<0.05 vs sham group; #P<0.05 vs ISO group.

3 過表達(dá)EndoA2改善ISO誘導(dǎo)的肥大心肌組織形態(tài)學(xué)變化

為了從形態(tài)上觀察肥大心肌細(xì)胞的變化情況，我們采用了HE染色的方法,結(jié)果顯示，與對照組相比，ISO組大鼠心肌細(xì)胞明顯增大;過表達(dá)EndoA2明顯抑制ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，而單獨(dú)過表達(dá)EndoA2對心肌細(xì)胞大小無影響，見圖3。

Figure 3.The representative images and analysis results of HE staining assessment of the myocardial hypertrophy after ISO injection. Mean±SD. n=5. *P<0.05 vs sham group; #P<0.05 vs ISO group.

4 過表達(dá)EndoA2抑制ISO誘導(dǎo)的胚胎基因表達(dá)

為了進(jìn)一步確證EndoA2可以抑制ISO誘導(dǎo)的大鼠心肌肥大，我們采用RT-qPCR檢測了胚胎基因的表達(dá),結(jié)果顯示過表達(dá)EndoA2可以明顯抑制ISO誘導(dǎo)的ANP、BNP及β-MHC的mRNA表達(dá)(P<0.05)，而單獨(dú)過表達(dá)EndoA2對胚胎基因的表達(dá)無影響，見圖4。

5 過表達(dá)EndoA2逆轉(zhuǎn)ISO引起的自噬水平降低

Figure 4.The mRNA expression of ANP, BNP and β-MHC after ISO injection. Mean±SD. n=5. *P<0.05 vs sham group; #P<0.05 vs ISO group.

為了研究過表達(dá)EndoA2減輕ISO誘導(dǎo)的心肌肥大的分子機(jī)制，我們利用Western blot法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3和P62的表達(dá),結(jié)果顯示與ISO處理組相比，過表達(dá)EndoA2明顯加強(qiáng)自噬，表現(xiàn)為LC3-II/LC3-I比值增加，P62表達(dá)減少(P<0.05);而單獨(dú)過表達(dá)EndoA2對LC3和P62的表達(dá)則無影響，見圖5。

討 論

心肌肥大是心肌細(xì)胞對急性心肌梗死、高血壓和主動脈狹窄等常見臨床疾病做出的適應(yīng)性反應(yīng)，以增加維持正常心臟功能的工作量，是一種代償性的改變[7-8]。但這種代償反應(yīng)會增加心肌耗氧量，而冠狀動脈的供血量不能滿足這種耗氧量的增加，從而導(dǎo)致心臟由代償性肥大過渡到失代償性肥大，最終導(dǎo)致心衰。臨床研究表明，心肌肥大是心血管疾

Figure 5.The representative images and analysis results of LC3 and P62 after ISO injection. Mean±SD. n=5. *P<0.05 vs sham group; #P<0.05 vs ISO group.

病發(fā)病率和死亡率居高不下的一個獨(dú)立危險(xiǎn)因素，逆轉(zhuǎn)心肌肥大可以顯著改善患者的預(yù)后。因此，深入研究心肌肥大的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的防治靶點(diǎn)，延緩心衰的進(jìn)程，一直是心血管疾病領(lǐng)域長期關(guān)注的研究課題。

心肌肥大是心臟一種適應(yīng)性的重塑反應(yīng)，病理生理改變以心肌細(xì)胞表面積增大、蛋白合成速率增加及胚胎基因的表達(dá)增加為主要特征。心肌肥大可由多種因素誘導(dǎo)，其中，ISO是建立心肌肥大實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ统Ｓ霉ぞ咚幹籟9-10]。本研究通過在左心室壁注射Ad-EndoA2腺病毒過表達(dá)EndoA2，然后皮下注射ISO構(gòu)建大鼠心肌肥大動物模型，觀察在整體動物水平EndoA2干預(yù)對心肌肥大的影響,結(jié)果表明過表達(dá)EndoA2可以減輕ISO誘導(dǎo)的心肌肥大，提示EndoA2可能是一個潛在的防治心肌肥大的藥物作用靶點(diǎn)。

EndoA2最初是作為兒童白血病染色體易位的融合基因而被發(fā)現(xiàn)的，廣泛分布在各種組織。早期關(guān)于該蛋白的研究主要集中在內(nèi)吞功能，該類蛋白可通過其C端的SH3結(jié)構(gòu)域與dynamin和synaptojanin等蛋白的多聚脯氨酸結(jié)構(gòu)域結(jié)合，調(diào)控突觸囊泡內(nèi)吞。近年來的資料顯示，EndoA2參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞泡沫化以及平滑肌細(xì)胞增殖與凋亡，提示EndoA2與心血管疾病密切相關(guān)[11-13]；我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，EndoA2通過抑制Bax從胞漿轉(zhuǎn)位線粒體，保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的大鼠腦基底動脈平滑肌細(xì)胞凋亡，從而調(diào)節(jié)血管重構(gòu)[11]；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，EndoA2促進(jìn)容積調(diào)節(jié)性氯通道蛋白ClC-3從胞漿轉(zhuǎn)位胞膜，從而促進(jìn)氯通道開放，調(diào)節(jié)ET-1或低滲誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞增殖[12]；此外，EndoA2通過ASK-JNK/P38信號通路增加巨噬細(xì)胞CD36和SR-A的表達(dá)，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞泡沫化[13]。以上結(jié)果提示EndoA2對動脈粥樣硬化、腦卒中等心血管疾病具有重要的調(diào)節(jié)作用。但EndoA2能否影響心肌肥大，目前尚不清楚。

在本課題中，我們在左心室壁注射Ad-EndoA2腺病毒，隨后利用ISO誘導(dǎo)大鼠心肌肥大模型，7 d 后用小動物超聲檢測大鼠心臟功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與ISO組相比，ISO+Ad-EndoA2組大鼠左室收縮期前壁厚度、左室收縮期后壁厚度、射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率均顯著下降，而左室收縮期內(nèi)徑以及心輸出量顯著增加，提示EndoA2可以減輕ISO誘導(dǎo)的心肌肥大，改善心功能。為了進(jìn)一步確證EndoA2在心肌肥大中的作用，我們采用了測量心臟重理指數(shù)、HE染色以及RT-qPCR等方法檢測心肌肥大,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與ISO組相比，ISO+Ad-EndoA2組大鼠的心臟重量指數(shù)、心肌細(xì)胞大小以及ANP、BNP和β-MHC的mRNA表達(dá)顯著減少，進(jìn)一步提示EndoA2可以抑制ISO誘導(dǎo)的心肌肥大。但EndoA2調(diào)控心肌肥大的分子機(jī)制尚不清楚。有研究報(bào)道自噬在ISO誘導(dǎo)的心肌肥大中發(fā)揮重要作用[10]，筆者前期研究證實(shí)EndoA2通過加強(qiáng)自噬保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡[14]，那么EndoA2是否通過調(diào)節(jié)自噬調(diào)控心肌肥大的呢？ LC3蛋白是自噬體形成的標(biāo)志蛋白。在自噬被誘導(dǎo)后，位于胞漿中的LC3-I與磷脂酰乙醇胺結(jié)合，形成錨定在自噬體膜上的LC3-II，標(biāo)志自噬體形成。P62通過直接與膜上的LC3-II結(jié)合，特異性地融合到自噬中而被降解。因此，P62的表達(dá)水平與自噬活性成反比。本研究的Western blot結(jié)果顯示，ISO誘導(dǎo)心肌肥大后，LC3-II/LC3-I比值下降，P62表達(dá)增加，自噬被抑制;過表達(dá)EndoA2明顯逆轉(zhuǎn)ISO引起的自噬水平降低。這表明EndoA2可能通過加強(qiáng)自噬減輕ISO誘導(dǎo)的心肌肥大。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)EndoA2可以減輕ISO誘導(dǎo)的心肌肥大，該作用可能與EndoA2加強(qiáng)自噬有關(guān)。今后的工作中，我們將進(jìn)一步在體外明確EndoA2調(diào)控心肌肥大的作用及具體分子機(jī)制，為明確EndoA2是否可以作為心肌肥大治療的新靶點(diǎn)提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。