響應(yīng)面法優(yōu)化酸棗仁多糖的脫色工藝

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(1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津 300134; 2.天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300134)

酸棗仁是鼠李科植物酸棗(ZiziphousjujubaMill.Var.Spinosa(Bunge)Hu.Et H.f.Chou)的干燥成熟種子,具有鎮(zhèn)靜催眠,補(bǔ)肝寧心等功效[1-2],臨床上常用于治療體虛多汗、虛煩不眠、津傷口渴、驚悸多夢(mèng)等癥[3-5]。酸棗仁在我國(guó)西北、東北及華北地區(qū)常見(jiàn)分布。酸棗仁中含有皂苷及三萜、黃酮、生物堿、脂肪酸和多糖等成分,但是目前關(guān)于酸棗仁的研究大都集中在黃酮、皂苷等化合物的研究[6],而關(guān)于多糖的研究報(bào)道少見(jiàn)。

目前關(guān)于植物多糖的相關(guān)研究越來(lái)越多,并且已有研究表明植物多糖在抗腫瘤、抗肝炎、調(diào)節(jié)糖代謝等方面表現(xiàn)出顯著的生物活性,且毒副作用低,已經(jīng)成為近年來(lái)藥品、保健食品研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一[7],而酸棗仁多糖具有較好的體液、細(xì)胞免疫功能,因此具有廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景[8]。植物多糖多具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu),由多個(gè)單糖通過(guò)糖苷鍵連接聚合,分子量高,利用傳統(tǒng)工藝提取的粗多糖通常顏色較深,純度不高,不利于產(chǎn)品的進(jìn)一步研究利用[9]。多糖的脫色處理應(yīng)用較多的是大孔吸附樹(shù)脂、纖維素吸附以及雙氧水脫色等方法。其中,大孔樹(shù)脂法具有操作簡(jiǎn)便、處理量大等諸多優(yōu)點(diǎn),被越來(lái)越多的應(yīng)用于脫色工藝研究中[10-12]。

本文利用大孔樹(shù)脂研究酸棗仁多糖的脫色工藝,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)法對(duì)酸棗仁多糖脫色工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,通過(guò)方程擬合優(yōu)化最優(yōu)脫色工藝,為深入開(kāi)發(fā)利用該多糖資源奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸棗仁 產(chǎn)自天津薊縣;D101、ADS-7、D3520大孔樹(shù)脂 天津南大樹(shù)脂科技有限公司;95%乙醇、硫酸、葡萄糖等試劑 均為分析純;水 為去離子水。

UV-2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津;TDA-8002型恒溫水浴鍋 天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司;KQ-500B型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;V-700型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Buchi公司;LG10-2.4A型高速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠;TS-100型數(shù)顯脫色搖床 上海書(shū)培實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;FA1004型(Max 100 g)型電子天平 上海精科天平有限公司;ALPHA 1-2LD PLUS型真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Marin Christ公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酸棗仁粗多糖的提取 酸棗仁粗多糖參考黃小娟等[13]的水提醇沉的提取方法提取,粉末狀干品。稱(chēng)取多糖干品于適量去離子水中,超聲輔助溶解,離心(4000 r/min,5 min),取上清,備用。

1.2.2 樹(shù)脂的篩選 分別量取75 mL預(yù)處理樹(shù)脂(D101、ADS-7、D3520)于250 mL錐形瓶中,每瓶加入50 mL質(zhì)量濃度為3 mg/mL的待處理樣品,置于搖床上緩慢搖晃(60 r/min)吸附3 h,過(guò)濾,測(cè)定濾液多糖脫色率和多糖保留率,據(jù)此選擇所用樹(shù)脂型號(hào)。

1.2.3 樹(shù)脂再生后對(duì)多糖脫色率和多糖保留率的影響 樹(shù)脂解吸附后,向盛有大孔吸附樹(shù)脂的錐形瓶中加4%的HCl高于樹(shù)脂層面10 cm,浸泡4 h。然后6倍量的相同濃度溶液進(jìn)行洗滌,隨后水洗至流出液pH約為7,隨后用4%的NaOH同上處理,最后再用純水洗至流出液pH約為7。樹(shù)脂再生處理后,通過(guò)測(cè)定前后純水洗滌液的吸光度值進(jìn)而評(píng)價(jià)其再生前后對(duì)多糖脫色率和多糖保留率的影響,評(píng)價(jià)其再生能力。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 經(jīng)多次預(yù)實(shí)驗(yàn),將上樣質(zhì)量濃度、上樣量和洗脫流速三個(gè)因素分別對(duì)D101大孔吸附樹(shù)脂對(duì)多糖脫色的影響進(jìn)行考察分析。

1.2.4.1 上樣質(zhì)量濃度對(duì)多糖脫色的影響 將經(jīng)過(guò)前處理的D101樹(shù)脂50 mL,裝柱(2.0 cm×25 cm玻璃層析柱),采用濃度為1、2、3、4、5 mg/mL的樣品上樣,上樣量及洗脫流速分別為3.5 mL及3 BV/h,超純水洗脫3 BV(1 BV=30 mL),研究上樣質(zhì)量濃度對(duì)多糖保留率和多糖脫色率的影響。

1.2.4.2 上樣量對(duì)多糖脫色的影響 將經(jīng)過(guò)前處理的D101樹(shù)脂50 mL,裝柱(2.0 cm×25 cm玻璃層析柱),分別以2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mL五個(gè)不同體積的上樣量進(jìn)行上樣,固定上樣濃度為3 mg/mL,洗脫流速為3 BV/h(1 BV=30 mL),超純水洗脫3 BV(1 BV=30 mL),研究上樣量對(duì)多糖保留率和多糖脫色率的影響。

1.2.4.3 洗脫流速對(duì)多糖脫色的影響 將經(jīng)過(guò)前處理的D101樹(shù)脂50 mL,裝柱(2.0 cm×25 cm玻璃層析柱),分別以1、2、3、4、5 BV/h的流速進(jìn)行洗脫,上樣量為3.5 mL,樣品濃度3 mg/mL,超純水洗脫3 BV(1 BV=30 mL),研究洗脫流速對(duì)多糖保留率和多糖脫色率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn) 通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn),選擇上樣質(zhì)量濃度(X1)、上樣量(X2)、洗脫流速(X3)為考察因素,以多糖脫色率和多糖保留率二者綜合考慮的歸一值(OD)作為試驗(yàn)考察的響應(yīng)值。經(jīng)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面分析,用Design-Expert 8.0.6軟件,進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn),篩選出最高響應(yīng)值以便找出多糖的最佳脫色工藝。試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)的因素水平編碼Table 1 Factors and levels coding of response surface design

1.2.6 多糖保留率測(cè)定

1.2.6.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備 稱(chēng)取一定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品加適量水溶解并混勻。分別量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,置于不同試管中,均加去離子水至2.0 mL,每管加6.0 mL硫酸-蒽酮溶液,混勻,靜置15 min,冷卻。在625 nm處測(cè)量其A值并以去離子水作空白。以葡萄糖的質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo),其A值為縱坐標(biāo),得:C=31.6A+0.0572,相關(guān)性系數(shù)R2=0.9991。

1.2.6.2 多糖保留率測(cè)定及計(jì)算方法 硫酸-蒽酮法用于測(cè)定樣品中的糖含量(以葡萄糖計(jì))[15]。利用紫外分光光度計(jì)測(cè)量溶液的A值,將測(cè)量所得的A值代入上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)以計(jì)算其多糖含量。

式中,Y2為多糖保留率,C1為脫色前多糖含量,C2為脫色后多糖含量。

1.2.7 多糖脫色率的測(cè)定 待測(cè)品進(jìn)行紫外全掃描后,確定色素的主要吸收峰在450 nm附近。選擇450 nm波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng),測(cè)定單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)中各溶液的吸光度,平行測(cè)定3次,測(cè)定溶液的吸光度。計(jì)算公式如下[16]:

式中,Y1為多糖脫色率,A1為脫色前多糖溶液吸光度,A2為脫色后多糖溶液吸光度。

1.2.8 歸一值OD的計(jì)算 以各指標(biāo)的最佳測(cè)定值為滿(mǎn)分,然后根據(jù)正比和反比關(guān)系將各值換成對(duì)應(yīng)的百分比,以多糖脫色率和多糖保留率為考察指標(biāo),根據(jù)各指標(biāo)的重要程度,確定其權(quán)重系數(shù)[14],按照綜合評(píng)判公式:歸一值OD=Mα/Y1+Nβ/Y2,其中,M、N分別為Y1(多糖脫色率)和Y2(多糖保留率)的權(quán)重系數(shù),M、N的值分別為0.5、0.5,α為20個(gè)Y1中最小值,β是20個(gè)Y2中最小值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次,數(shù)據(jù)用“平均值±SD”表示,圖像采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行分析處理;采用Design-Expert 8.0.6軟件建立數(shù)學(xué)模型進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹(shù)脂的篩選

在實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的基礎(chǔ)上選取D101、D3520、ADS-7 3種不同型號(hào)的大孔樹(shù)脂的以多糖脫色率和多糖保留率值為考察對(duì)象進(jìn)行樹(shù)脂類(lèi)型的篩選。結(jié)果如表2所示,D101脫色率(49.61%)只比D3520脫色率(52.64%)稍低,但保留率(75.78%)最高,而ADS-7樹(shù)脂的多糖脫色率(47.13%)及多糖保留率(52.40%)均低于D101及D3520的多糖脫色率和多糖保留率值。因此,考慮到多糖脫色工藝的效率及資源的節(jié)約,選擇D101對(duì)樣品脫色處理。

表2 3種樹(shù)脂對(duì)酸棗仁多糖的脫色率與多糖保留率影響Table 2 Effects of 3 resins on the decolorization and retention rate of ZSS polysaccharide

不同型號(hào)的樹(shù)脂的吸附能力對(duì)樣品脫色工藝具有較大的影響,極性及空間結(jié)構(gòu)(孔徑、比表面積等)對(duì)其吸附能力具有決定作用。由表2知,D101和D3520為非極性大孔樹(shù)脂,而ADS-7是極性樹(shù)脂。D101的平均孔徑(25～28 ?)小于D3520(85～90 ?),比表面積(≥550 m2/g)和D3520(480～520 m2/g),所以二者對(duì)小分子樣品的吸附能力相差不大。多糖一般都是具有較大分子量的物質(zhì),其純化是去除色素等小分子的雜質(zhì),由表2可看出，D101樹(shù)脂的脫色率及保留率均高于ADS-7樹(shù)脂；與D3520樹(shù)脂的多糖脫色率及多糖保留率相比，D101樹(shù)脂也明顯高于D3520樹(shù)脂的多糖保留率，而多糖脫色率稍低于D3520樹(shù)脂的多糖脫色率。綜合分析，D101樹(shù)脂更合適用于樹(shù)脂的脫色，因此將D101用于脫色工藝。

2.2 D101大孔吸附樹(shù)脂再生后脫色的結(jié)果

D101大孔吸附樹(shù)脂再生后脫色的結(jié)果如表3所示,從3表可看出,D101樹(shù)脂經(jīng)過(guò)再生后對(duì)多糖脫色效果略有下降。

表3 D101大孔吸附樹(shù)脂新生及再生后對(duì)多糖脫色和多糖保留率效果Table 3 Effects of generation and regeneration of D101 macroporous adsorption resin on the decolorization and retention rate of polysaccharide macroporous resin

樹(shù)脂使用多次后,其表面及內(nèi)部會(huì)吸附許多雜質(zhì),使樹(shù)脂的表面發(fā)生顏色變化,純化能力下降,因而要對(duì)其再生處理。表3表明,在相同條件下,由于大孔吸附樹(shù)脂使用過(guò)后會(huì)產(chǎn)生部分死體積而造成多糖保留率略有下降,但是多次使用以后多糖保留率略有升高,脫色能力下降。可能原因?yàn)闃?shù)脂經(jīng)過(guò)多次試用而產(chǎn)生死體積使其脫色能力下降,吸附能力下降進(jìn)而導(dǎo)致多糖保留率的升高[17]。因此,該樹(shù)脂具有一定的再生價(jià)值。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 上樣質(zhì)量濃度對(duì)多糖脫色率及多糖保留率的影響 由圖1實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,在1～5 mg/mL的上樣質(zhì)量濃度范圍內(nèi),隨著上樣質(zhì)量濃度的增加多糖的保留率表現(xiàn)出增加的趨勢(shì),但是在大于3 mg/mL時(shí)這種增長(zhǎng)趨勢(shì)變緩。然而樣品的脫色率隨著上樣質(zhì)量濃度的增加表現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì),當(dāng)濃度大于3 mg/mL時(shí)這種下降趨勢(shì)更為明顯,這可能是由于色素的吸附使樹(shù)脂的接觸面飽和而使其吸附能力下降有關(guān)[17]。本試驗(yàn)在上樣質(zhì)量濃度對(duì)多糖脫色效果的考察中,綜合考慮對(duì)多糖脫色率及多糖保留率的影響,選擇3 mg/mL為多糖脫色工藝的上樣質(zhì)量濃度。

圖1 上樣質(zhì)量濃度對(duì)多糖脫色率和多糖保留率的影響Fig.1 Effect of sample concentration on decolorization and retention rate of polysaccharides

2.3.2 上樣量對(duì)多糖脫色率及保留率的影響 由圖2實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,在2.5～4.5 mL的上樣量范圍內(nèi),固定一定的洗脫流速及上樣質(zhì)量濃度,多糖保留率隨著上樣量的增加而增加,但是在大于3.5 mL時(shí)這種增長(zhǎng)趨勢(shì)變緩。在相同的條件下,多糖的脫色率表現(xiàn)出明顯的相反趨勢(shì),說(shuō)明樹(shù)脂對(duì)色素的吸附在一定范圍達(dá)到飽和,樹(shù)脂的脫色率下降。本試驗(yàn)在上樣量對(duì)多糖脫色效果的考察中,綜合考慮對(duì)多糖脫色率和多糖保留率影響后,以3.5 mL為樣品較適宜的上樣量。

2.3.3 洗脫流速對(duì)多糖脫色率及保留率的影響 由圖3實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,在1.0～5.0 BV/h的洗脫流速范圍內(nèi)，多糖的保留率隨著洗脫流速的增加而增加,主要原因是隨著洗脫流速的增加多糖與樹(shù)脂的接觸時(shí)間縮短,當(dāng)上樣完成進(jìn)行洗脫時(shí)多糖更快的流出色譜柱,減少了多糖在樹(shù)脂中的吸附損耗因而使其保留率增加;但是在相同的實(shí)驗(yàn)條件下,多糖脫色率表現(xiàn)出明顯的降低趨勢(shì),主要可能原因是過(guò)快的流速減少了多糖溶液與樹(shù)脂的接觸時(shí)間,因而降低了樹(shù)脂的吸附能力[18],降低了脫色的效率。本試驗(yàn)在洗脫流速對(duì)多糖脫色效果的考察中,相同實(shí)驗(yàn)條件下隨著洗脫流速的增加多糖脫色率減少但多糖保留率增加,綜合考慮對(duì)多糖脫色率和多糖保留率影響后,以3 BV/h為樣品較適宜的洗脫流速。

圖3 洗脫流速對(duì)脫色率及多糖保留率的影響Fig.3 Effects of elution velocity on decolorization and retention rate of polysaccharide

2.4 酸棗仁多糖脫色工藝響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表3中的因素與水平值,按照Box-Behnken設(shè)計(jì),共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn),其中13組為析因點(diǎn),4組為零點(diǎn),每組進(jìn)行平行試驗(yàn)。其試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Design and results of response surface test

2.5 擬合模型的建立與數(shù)據(jù)分析

以Design-Expert 8.0.6分析對(duì)表4中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析,建立二次回歸模型,確定以多糖脫色率和多糖保留率的歸一值(OD)為優(yōu)化指標(biāo),由此得出酸棗仁多糖脫色工藝的二次多項(xiàng)回歸方程:

由表5可知,模型p<0.01,因此認(rèn)為此模型具有極顯著性。該回歸方程的模型擬合度具有顯著水平,模型相關(guān)系數(shù)(R2=0.9963)較高,失擬項(xiàng)顯示不顯著,表明模型擬合程度好,試驗(yàn)誤差小,因此模型可用于預(yù)測(cè)本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表5 回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model

2.5.1 兩因素交互效應(yīng)分析 以Design-Expert V8.0.6的三維響應(yīng)面來(lái)找出最佳優(yōu)化工藝,通過(guò)確定3個(gè)影響因素之一為中值,將中值代入回歸模型方程得新方程,根據(jù)新的模型方程得到三維響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖,并從中確定OD最優(yōu)條件,結(jié)果如圖5。

根據(jù)響應(yīng)面的設(shè)計(jì)原理,響應(yīng)面的圖越彎曲,兩個(gè)因素間作用越顯著,由此可體現(xiàn)出各因素間交互作用對(duì)OD的影響大小。比較圖4中3組圖可知,X1和X2兩兩之間交互作用對(duì)OD影響顯著(p<0.05),上X1和X3、X2和X3水平之間交互作用對(duì)OD影響不顯著(p>0.05)。

圖4 各因素交互作用對(duì)酸棗仁多糖脫色工藝影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface graph interaction factors of the ZSS polysaccharide decolorization process

2.5.2 最佳工藝條件驗(yàn)證 根據(jù)OD值的計(jì)算方式[19],得到OD值的理論最低值為0.55，在此條件下找到實(shí)際自變量的范圍，具體為：上樣濃度為2 mg/mL,上樣量為3.5 mL,洗脫速度為4 BV/h。根據(jù)最佳優(yōu)化條件,進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)測(cè)得多糖脫色率均值為61.32%,多糖保留率均值為87.05%,其OD值為0.56。預(yù)測(cè)值為0.55,預(yù)測(cè)值與實(shí)際測(cè)得值相比,其相對(duì)誤差較小,說(shuō)明本試驗(yàn)的模型可較好的預(yù)測(cè)各因素與效應(yīng)面之間的變化關(guān)系。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)及Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì),利用Design-Expert 8.0.6軟件優(yōu)化酸棗仁多糖脫色工藝。各因素對(duì)酸棗仁多糖脫色率和多糖保留率的影響大小為:洗脫速度(X3)>上樣質(zhì)量濃度(X1)>上樣量(X2)。由回歸分析結(jié)果表明酸棗仁多糖的最優(yōu)脫色工藝為:上樣質(zhì)量濃度2 mg/mL,上樣量3.5 mL,洗脫流速4 BV/h,并進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn),測(cè)得的多糖脫色率和多糖保留率的平均值分別為61.32%和87.05%,其OD值為0.56。結(jié)果與模型預(yù)測(cè)值偏差較小,則本次實(shí)驗(yàn)所得模型能用于預(yù)測(cè)各因素與效應(yīng)面之間的變化關(guān)系。