風(fēng)味蛋白酶酶解制備中國(guó)對(duì)蝦調(diào)味料風(fēng)味前體物質(zhì)工藝優(yōu)化

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(1.浙江工商大學(xué)食品科學(xué)與生物工程學(xué)院,浙江杭州 310018; 2.浙江工商大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,浙江杭州 310018)

作為“世界三大名蝦”之一的中國(guó)對(duì)蝦(Penaeuschinensis),又名東方對(duì)蝦,中國(guó)明對(duì)蝦。主要分布在我國(guó)黃、渤海海區(qū),與其它種類(lèi)的中國(guó)養(yǎng)殖蝦相比,中國(guó)對(duì)蝦分布最為廣泛,在我國(guó)水產(chǎn)品出口中占有重要地位[1]。中國(guó)對(duì)蝦不僅具有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分,而且滋味鮮美,其蛋白質(zhì)成分比一般魚(yú)類(lèi)肌肉、牛肉、豬肉都高,是典型的高蛋白低脂肪類(lèi)的食物[2];此外,它還含有豐富的不飽和脂肪酸,約占總脂肪的66.2%[3]。中國(guó)對(duì)蝦的加工利用,主要是針對(duì)對(duì)蝦仁,因此有效的利用頭、皮、殼、尾、骨及殘余的肉等下腳料,不僅可以使資源得到最大化的利用,還能避免下腳料所引起的環(huán)境污染問(wèn)題[4-5];目前,在對(duì)蝦下腳料的精加工方面,主要包括:提取蛋白質(zhì),幾丁質(zhì),蝦青素,礦物質(zhì),維生素等[6-7],還可用于生產(chǎn)蝦醬[8-9]、蝦黃粉、蝦的風(fēng)味料[10]等方面。

在酶作用下,把蛋白質(zhì)分子切割成小肽、脂肪酸、氨基酸等小分子物質(zhì),可獲得具有復(fù)雜體系的酶解液。利用蛋白酶酶解技術(shù)所獲酶解液通常富含各種游離氨基酸,可用于增加調(diào)味品香味。該方法不僅反應(yīng)條件溫和,操作簡(jiǎn)單,且能有效避免對(duì)風(fēng)味前體物質(zhì)的破壞。徐坤華等[11]以堿性蛋白酶水解中華管鞭蝦蝦頭制備酶解液,優(yōu)化條件下,所得酶解液中游離氨基酸增加了57.49%,其中呈味氨基酸有明顯增加。李冬梅等[12]比較研究了不同蛋白酶對(duì)制備中國(guó)對(duì)蝦酶解液的影響,MRPs的感官評(píng)價(jià)顯示,復(fù)合蛋白酶制得的酶解液在鮮味、持續(xù)感和醇厚味方面均比其他蛋白酶強(qiáng)。此外,相關(guān)酶解技術(shù)在薩拉米、羊肉風(fēng)味基料及魚(yú)肉蛋白的制備等方面也得到了廣泛應(yīng)用[13-16],盡管采用單一蛋白酶酶解制備風(fēng)味料有一定的功效,但是由于蛋白酶對(duì)肽鍵具有專(zhuān)一性,利用單一蛋白酶水解物料時(shí),往往會(huì)對(duì)物料的酶解度產(chǎn)生制約作用,不利于提高酶解液的風(fēng)味;采用多種蛋白酶聯(lián)合制備酶解液,因不同蛋白酶作用位點(diǎn)不同,所形成肽類(lèi)物質(zhì)的長(zhǎng)度也存在差異,有助于形成濃郁的風(fēng)味,多種蛋白酶聯(lián)合酶解工藝在玉米多肽,馬鹿茸降血糖肽以及鯽魚(yú)酶解液等[17-18]制備研究中均取得較好的效果。在蝦類(lèi)酶解液制備中也有蛋白酶分步酶解[19-20]、復(fù)合酶解[21-22]相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究首先選用六種不同蛋白酶對(duì)中國(guó)對(duì)蝦下腳料進(jìn)行酶解,在總結(jié)六種酶的酶解反應(yīng)特性基礎(chǔ)上,篩選出較好的雙酶分步酶解組合;采用響應(yīng)面分析法對(duì)分步酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化,并采用氨基酸含量變化及感官評(píng)定來(lái)評(píng)價(jià)酶解工藝。此酶解工藝可以為工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中國(guó)對(duì)蝦下腳料 浙江省舟山市;甲醛 分析純,邁瑞化學(xué)試劑有限公司;胰蛋白酶(Trypsin) 1.5×105U·g-1食品級(jí);中性蛋白酶(Dispase) 1.0×105U·g-1食品級(jí);風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme) 5.8×104U·g-1食品級(jí);堿性蛋白酶(Alcalase) 2.8×104U·g-1食品級(jí);木瓜蛋白酶(Papain) 2.3×104U·g-1食品級(jí);胃蛋白酶(Pepsin) 2.9×105U·g-1食品級(jí);均由諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司提供。

HC700 打粉機(jī) 永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司;Contfuge stratus高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司;LGJ.15冷凍干燥機(jī) 上海醫(yī)用分析儀器廠;L-8900氨基酸自動(dòng)分析儀 日本日立公司;HH-2數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司;Delta320 DELTA320 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 中國(guó)對(duì)蝦下腳料的前處理 將中國(guó)對(duì)蝦下腳料先常溫解凍然后加入等量的水混合,再倒入膠體磨粉碎直至蝦漿中沒(méi)有大的顆粒存在(打粉機(jī),3000 r/min,2 min),最后在將其冷凍干燥(冷凍干燥機(jī),-40 ℃,24 h),裝入真空袋里留其備用。

1.2.2 酶的篩選 實(shí)驗(yàn)中分別選取胰蛋白酶(Trypsin)、中性蛋白酶(Dispase)、風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme)、堿性蛋白酶(Alcalase)、木瓜蛋白酶(Papain)、胃蛋白酶(Pepsin)對(duì)蝦粉進(jìn)行酶解,并根據(jù)相應(yīng)文獻(xiàn)和各種酶的最適反應(yīng)條件[23],選取出本實(shí)驗(yàn)中的反應(yīng)條件,反應(yīng)條件如下:料液比1∶9、蛋白酶用量(酶與底物質(zhì)量比)2%、酶解時(shí)間3 h,初始pH和溫度根據(jù)如圖1所示的各種酶的最適pH和最適溫度來(lái)確定,在此條件下通過(guò)水解程度和感官評(píng)價(jià)等方法來(lái)比較各種蛋白酶對(duì)中國(guó)對(duì)蝦下腳料酶解的影響。

表1 各種蛋白酶的酶解反應(yīng)特性Table 1 Specialties of several proteases during enzymolysis

1.2.3 復(fù)合酶組合的確定 選取上述風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶進(jìn)行組合,組合形式如下:堿性蛋白+風(fēng)味蛋白、中性蛋白+風(fēng)味蛋白、堿性蛋白+中性蛋白、風(fēng)味蛋白+堿性蛋白、風(fēng)味蛋白+中性蛋白。并對(duì)蝦粉進(jìn)行酶解,酶解條件如下:料液比1∶9、蛋白酶用量(酶與底物質(zhì)量比)2%、酶解時(shí)間3 h,初始pH和溫度根據(jù)如圖1所示的各種酶的最適pH和最適溫度來(lái)確定,通過(guò)比較各復(fù)合酶對(duì)蝦粉的水解度和酶解液的風(fēng)味來(lái)確定本實(shí)驗(yàn)的復(fù)合酶。

圖1 酶解溫度、初始pH及風(fēng)味蛋白酶用量對(duì)水解度的影響Fig.1 Effect of temperature,primary pH and Flavourzyme amount on DH of Penaeus Chinensis waste

1.2.4 酶解液的制備 第一步酶解工藝確定:料水比1∶9,堿性蛋白酶用量2.4%,酶解溫度58 ℃,初始pH7.5,酶解時(shí)間3 h[23]。本文主要研究第二步酶解工藝:第一步酶解結(jié)束后進(jìn)行滅酶處理(即在沸水浴中對(duì)蝦粉漿狀物水浴加熱10 min),在以風(fēng)味蛋白酶繼續(xù)水解并考察其單因素。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下:稱取一定量的蝦粉,按一定料液比分散于蒸餾水中,調(diào)節(jié)初始pH,然后將樣品置于恒溫水浴鍋中,在一定溫度下加入酶進(jìn)行酶解反應(yīng)。恒溫反應(yīng)3 h后,將酶解物置于沸水浴中滅酶10 min。水解液在3000 r/min下離心10 min,取上清液用于水解度測(cè)定(Degree of hydrolysis,DH)。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 分別以酶解液風(fēng)味和水解度為指標(biāo),研究溫度、初始pH、酶用量對(duì)水解度的影響。

1.2.5.1 研究溫度對(duì)水解度的影響 分別選取40、45、50、55、60、65、70、75 ℃溫度為實(shí)驗(yàn)條件,其它條件為:料液比1∶9、初始pH7、蛋白酶用量(酶與底物質(zhì)量比)2%、酶解時(shí)間3 h。

1.2.5.2 研究初始pH對(duì)水解度的影響 分別選取5、5.5、6、6.5、7、7.5、8初始pH為實(shí)驗(yàn)條件,其它條件為:料液比1∶9、溫度60 ℃、蛋白酶用量(酶與底物質(zhì)量比)2%、酶解時(shí)間3 h。

1.2.5.3 研究酶用量對(duì)水解度的影響 分別選取0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%風(fēng)味蛋白酶用量為實(shí)驗(yàn)條件,其它條件為:料液比1∶9、溫度60 ℃、初始pH7、酶解時(shí)間3 h。

1.2.6 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化第二步酶解工藝,以水解度為指標(biāo)確定最佳酶解工藝。實(shí)驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)如表2所示,分別以風(fēng)味蛋白酶用量、初始pH和酶解溫度為參考因素,水解度為響應(yīng)值,采用三因素三水平設(shè)計(jì)法確定中國(guó)對(duì)蝦下腳料最佳酶解工藝條件。

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的因素水平及編碼水平Table 2 Experimental range and factor levels for esterification process

1.2.7 水解度的計(jì)算 按國(guó)標(biāo)GB/T 5009.39-2003采用甲醛電位滴定法測(cè)定酶解液中氨基態(tài)氮含量,并利用凱氏定氮法測(cè)定其中的總氮含量,以求得水解度[24-25]。

1.2.8 感官評(píng)定 將處理好的酶解產(chǎn)物放在65 ℃的水浴鍋中保溫,然后由20位評(píng)香人員用聞香紙蘸取酶解產(chǎn)物,并且將聞香紙浸入產(chǎn)物2～3 cm深,浸潤(rùn)1 min后取出,再將聞香紙放在離鼻2～3 cm的地方吸氣,每次2～3次,評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表3。

表3 蝦粉酶解液的感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Sensory evaluation standard of shrimp powder enzymolysis solution

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均為三次實(shí)驗(yàn)的平均值,誤差為標(biāo)準(zhǔn)誤差;采用Origin 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和繪圖;響應(yīng)面設(shè)計(jì)軟件(Version 6.0.5,Stat-Ease.Inc.,USA)對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行分析與優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶種類(lèi)的確定

由于蛋白酶對(duì)肽鍵的專(zhuān)一性,不同酶進(jìn)行酶解時(shí)常具有不同的酶解性能,具體結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可見(jiàn),在該酶解條件下,采用胰蛋白酶酶解中國(guó)對(duì)蝦下腳料,所獲產(chǎn)物的蝦味較濃郁,無(wú)雜味,但是水解度相對(duì)較低;用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解時(shí)產(chǎn)物的蝦味一般,有雜味,不能用以改善食品的風(fēng)味,不予采用;風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶以及中性蛋白酶進(jìn)行酶解時(shí),不僅水解度相對(duì)較高,且水解產(chǎn)物的蝦味濃郁,無(wú)雜味。因此,選取這三種水解度高、水解產(chǎn)物風(fēng)味好的酶(風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶以及中性蛋白酶)作為研究對(duì)象,從中篩選出制備中國(guó)對(duì)蝦酶解液的最佳酶解組合。

表4 各種蛋白酶的水解度與感官評(píng)定Table 4 Hydrolysis degree and sensory evaluation of various proteases

2.2 蛋白酶復(fù)合酶解組合的確定

內(nèi)肽酶進(jìn)行酶解時(shí)對(duì)疏水性或堿性殘基的C末端多肽結(jié)合特異性較差,易形成小分子量的苦味肽;而外肽酶則可以有效切除此類(lèi)疏水性氨基酸,使肽的苦味明顯下降,從而改善酶解產(chǎn)物的滋味[26]。堿性蛋白酶和中性蛋白酶是內(nèi)肽酶,風(fēng)味蛋白酶是內(nèi)、外肽酶,為了提高蛋白質(zhì)利用率并改善酶解液的苦味,實(shí)驗(yàn)中選用雙酶來(lái)酶解中國(guó)對(duì)蝦下腳料,酶解效果見(jiàn)表5。由表可見(jiàn),風(fēng)味蛋白酶與堿性蛋白酶、中性蛋白酶的組合均比上述單酶水解中國(guó)對(duì)蝦下腳料時(shí)的水解度高。將風(fēng)味蛋白酶應(yīng)用于第二步酶解中,雖然水解度略有降低,但能減少或掩蓋內(nèi)肽酶酶解所帶來(lái)的苦味[27],且酶解液蝦味醇厚,無(wú)腥味。因此,綜合各種因素,選擇堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶組合作為中國(guó)對(duì)蝦下腳料分步酶解時(shí)的較佳組合。

表5 不同酶組合分步酶解中國(guó)對(duì)蝦下腳料酶解效果比較Table 5 Comparison of effects of Penaeus chinensis waste by the double-enzyme stepwise hydrolysis

2.3 風(fēng)味蛋白酶酶解工藝條件優(yōu)化

以風(fēng)味蛋白酶作為本實(shí)驗(yàn)的酶解蛋白,考察溫度、初始pH、風(fēng)味蛋白酶用量對(duì)蝦粉水解率的影響,結(jié)果如圖1所示。由圖1a可知,溫度為40 ℃時(shí),水解度最低,水解度為35%,這是由于在低溫的狀況下,酶的活性被抑制,導(dǎo)致水解度較低,當(dāng)溫度開(kāi)始逐漸升高時(shí),水解度逐漸變大,在60 ℃時(shí)達(dá)到最高,繼續(xù)升高溫度水解度迅速降低,這是由于溫度過(guò)高導(dǎo)致酶失活以及被分解,從而影響酶解反應(yīng)。綜合以上分析,溫度過(guò)低或過(guò)高都不利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行,故選擇酶解溫度為60 ℃,此時(shí)水解度最大為53.5%。除了溫度之外,酸堿度對(duì)酶的活性也有影響。

圖1b為初始pH對(duì)水解度的影響。由圖可見(jiàn),在pH5.0～8.0范圍內(nèi),pH為5時(shí),水解度低,此時(shí)由于酸度低酶沒(méi)有失活,但酶的活性被影響了,當(dāng)pH繼續(xù)變大,水解度升高,當(dāng)pH達(dá)到6.5時(shí),水解度最大,水解度為53.5%,繼續(xù)增加初始pH,水解度迅速降低,這可能是由于pH對(duì)酶的活性部位以及酶與底物結(jié)合的影響導(dǎo)致酶活性在pH為6.5時(shí),水解度最大。故最適初始pH設(shè)定為6.5。

由圖1c可知,水解度隨著風(fēng)味蛋白酶用量的增加而增加,當(dāng)酶用量為2.0%時(shí)水解度最大,此時(shí)酶與底物之間的濃度達(dá)到飽和,繼續(xù)增加酶用量對(duì)酶水解蛋白質(zhì)產(chǎn)生作用較小,且當(dāng)酶用量達(dá)到一定值后過(guò)多酶的存在反而抑制酶的酶解活性,降低水解度,因此,2.0%作為最適酶用量。

2.4 響應(yīng)面分析法優(yōu)化風(fēng)味蛋白酶酶解工藝條件

根據(jù)Box-Benhnken模型的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[28],在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)軟件(Version 6.0.5,Stat-Ease.Inc.,USA)對(duì)中國(guó)對(duì)蝦下腳料酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表6,如表6所示,分別以X1、X2和X3為自變量,水解度為響應(yīng)值(Y),其中實(shí)驗(yàn)1～12為析因試驗(yàn),13～17為區(qū)域中心點(diǎn)5組重復(fù)試驗(yàn),用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。

表6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Design and results of response surface methodology

采用Design 7.0軟件對(duì)表6中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,獲得回歸方程為:

Y=+53.52+2.10X1-2.43X2-3.76X3-2.99X12-4.12X22-6.92X32+0.70X1X2-1.16X1X3+0.15X2X3

根據(jù)方差分析表7中的分析結(jié)果可得:所有的一次項(xiàng)及二次項(xiàng)都極顯著,但是在三因素的交互作用中,X1與X2交互作用顯著,X1與X3交互作用極其顯著,X2與X3交互作用不顯著;此外,該實(shí)驗(yàn)的精密度(Adeq precision)為39.35,說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)不僅合理而且精確度和可信度較高。

表7 模型回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)和結(jié)果Table 7 Significance test and results for regression coefficients of model

響應(yīng)面分析圖形是響應(yīng)值與各因子所構(gòu)成的一個(gè)三維空間曲面圖和等高線圖,可以從中看出各因素之間的相互影響并確定該實(shí)驗(yàn)的最佳條件。在響應(yīng)面圖中可以直觀地看出加酶量、初始pH、酶解溫度對(duì)水解度的影響,以及三因素間的交互關(guān)系對(duì)響應(yīng)值的影響。

從圖2a和圖2d以及等高線的形狀及疏密程度可知,加酶量與初始pH交互作用顯著,且初始pH較酶用量對(duì)響應(yīng)值的影響更大。同樣,在圖2b和圖2e中,當(dāng)酶用量保持在較佳水平(2.0%)時(shí),沿著酶解溫度升高方向的等高線密度更大,且水解度逐漸降低,說(shuō)明與酶用量相比,酶解溫度對(duì)水解度更為敏感,且與響應(yīng)值呈負(fù)相關(guān),此外由等高線的形狀來(lái)看,兩因素交互作用極為顯著;對(duì)于圖2c和圖2f,從響應(yīng)面三維圖可知,初始pH與酶解溫度間相互作用不顯著,酶解溫度比初始pH對(duì)水解度的影響更大,上述結(jié)果與表7方差分析相一致。

圖2 各因素對(duì)水解度交互作用的響應(yīng)面和等高圖Fig.2 Responsive surface and contour plots for the effect of various factors on the degree of hydrolysis(DH)

通過(guò)響應(yīng)面軟件分析,對(duì)風(fēng)味蛋白酶二次酶解中國(guó)對(duì)蝦下腳料工藝進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果顯示:在料水比1∶9、風(fēng)味蛋白酶用量2.19%、初始pH6.36、酶解溫度58.6 ℃、酶解時(shí)間3 h條件下,中國(guó)對(duì)蝦下腳料水解度為54.88%。為了實(shí)驗(yàn)操作便利,將上述最佳工藝條件進(jìn)行修正:在料水比1∶9、風(fēng)味蛋白酶用量2.2%、初始pH6.4、酶解溫度59 ℃、酶解時(shí)間3 h的條件下,經(jīng)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn),中國(guó)對(duì)蝦下腳料水解度為54.79%±0.34%,實(shí)驗(yàn)值基本與理論預(yù)測(cè)值相一致,表明該回歸方程可靠,能夠反映上述三個(gè)因素對(duì)中國(guó)對(duì)蝦下腳料水解度的影響。

2.5 酶解前后氨基酸含量的變化

游離氨基酸是水產(chǎn)動(dòng)物呈味的基礎(chǔ)物質(zhì)和主要鮮味對(duì)象,結(jié)果如表8。由表8可見(jiàn),雙酶分步酶解中國(guó)對(duì)蝦下腳料可以明顯的增加酶解液中氨基酸含量。酶解液中總氨基酸含量達(dá)到33.6862 mg/mL,與原料相比總氨基酸含量大大提高。其中,酶解產(chǎn)物中呈鮮味的氨基酸谷氨酸,賴氨酸含量分別增加了10.93及6.95 mg/mL;酪氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、精氨酸等呈苦味的氨基酸含量雖有增加,但相對(duì)而言,呈鮮味的氨基酸含量增加幅度更大,因此對(duì)蝦下腳料經(jīng)酶解后的鮮味強(qiáng)度得到了較大的提高。酶解液中除色氨酸之外,含有其余7種人體必需氨基酸,含量達(dá)到27.2543 mg/mL。因此雙酶分步酶解中國(guó)對(duì)蝦下腳料能明顯的提高中國(guó)對(duì)蝦下腳料酶解液的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

表8 酶解前后體系的游離氨基酸變化Table 8 Changes of free amino acids components before and after enzymatic hydrolysis

3 結(jié)論

為了獲得具有濃郁蝦風(fēng)味的風(fēng)味基料,提高中國(guó)對(duì)蝦的整體價(jià)值及利用率,本研究通過(guò)復(fù)合酶解工藝,即在堿性蛋白酶初步水解中國(guó)對(duì)蝦下腳料的基礎(chǔ)上再采用風(fēng)味蛋白酶對(duì)其進(jìn)行酶解;研究表明:在料水比1∶9、風(fēng)味蛋白酶用量2.2%、初始pH6.4、酶解溫度59 ℃、酶解時(shí)間3 h。中國(guó)對(duì)蝦下腳料水解度為54.79%,感官評(píng)價(jià)良好。酶解液中氨基酸含量為33.6862 mg/mL,其中必需氨基酸含量為27.2543 mg/mL,其中谷氨酸與賴氨酸含量大大增加,鮮味強(qiáng)度得到了極大的增強(qiáng),可作為蝦風(fēng)味調(diào)味基料。