Jagged 1在輻射誘導肺纖維化中的作用

來志揚,魏仲航

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 1.放射線科；2.急救醫(yī)學科，吉林 長春130033)

Jagged1(JAG1)可以調節(jié)諸多細胞表型，并在輻射誘導的肺纖維化過程中發(fā)揮重要作用，在肺損傷發(fā)展過程中，血管周圍成纖維細胞中的Notch被激活，激活的Notch可與JAG1結合，并抑制肺組織正常的損傷修復過程，從而促進肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。放射性肺纖維化是放射治療最為棘手的并發(fā)癥之一。如何減少放射性肺纖維化的發(fā)生、減輕肺纖維化程度，以增強放療的效果已經(jīng)成為腫瘤放射治療的一個熱點。了解掌握JAG1在肺纖維化發(fā)生、發(fā)展中的分子機制，對防治肺纖維化，減少并發(fā)癥的發(fā)生具有重要意義。本文對JAG1在放射性肺纖維化中作用的分子機制及治療進展進行綜述。

哺乳動物有4種Notch受體(Notch1-4)和5種Notch配體(Delta-like1/3/4，Jagged1/2)。Notch信號的產(chǎn)生是通過相鄰細胞的Notch配體與受體相互作用，Notch蛋白經(jīng)過3次剪切，由胞內(nèi)段(NICD)釋放入胞質，并進入細胞核與轉錄因子CSL結合，形成NICD/CSL轉錄激活復合體，從而激活HES、HEY等堿性螺旋轉錄抑制因子家族的靶基因，發(fā)揮生物學作用[1-3]。

肺部受到輻照或化學藥物損傷過程中，成纖維細胞產(chǎn)生的少量基質可以促進損傷修復，但當產(chǎn)生基質過多的時候，就可以形成瘢痕或纖維化。所以成纖維細胞是纖維化形成過程中的核心細胞[4,5]，在肺損傷修復過程中同樣發(fā)揮至關重要作用。Notch-JAG1主要作用是調節(jié)肺細胞的表型，從而發(fā)揮生物學功能，包括調節(jié)肺動脈細胞、支氣管平滑肌細胞，所以Notch-JAG1可能在肺成纖維細胞中也有調控作用[6,7]。

1 材料與方法

1.1材料人肺成纖維細胞系HLF購于美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)；DMEM培養(yǎng)基、PBS、胰蛋白酶、胎牛血清購于美國Gibco；siRNA-JAD1購于中國蘇州吉瑪基因。α-SMA、Collagen-1、JAG1單克隆抗體購于美國Abcam；MTT試劑盒購于博士德生物有限公司。

1.2細胞分組常規(guī)復蘇HLF細胞，將細胞接種于含有1%雙抗+10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期的HLF細胞并接種于4個10 cm培養(yǎng)皿中，調整細胞融合率為50%左右，分為4組，即對照組(control)、照射組(IR)、siRNA抑制組(siRNA-JAG1)、抑制+照射組(siRNA+IR)，抑制組和抑制+照射組轉染siRNA-JAG1，轉染后24 h，照射組與抑制+照射組進行10Gy X-Ray輻照隨后進行后續(xù)實驗。

1.3蛋白表達檢測

收集各組細胞并提取總蛋白，測定每組蛋白濃度，取適量樣品行Western Blot凝膠電泳實驗，轉至硝酸纖維膜，將膜置于10%牛奶的封閉液中，室溫封閉2 h，分別加入α-SMA、Collagen-1、JAG1單克隆抗體(1∶1 000)置于4℃過夜，二抗(1∶10 000)室溫2 h，按ECL試劑盒說明進行電化學發(fā)光檢測。

1.4mRNA水平檢測

收集各組細胞并提取總RNA，測定每組RNA濃度，用takala逆轉錄試劑盒將得到的RNA逆轉錄成cDNA，按照常規(guī)實時定量熒光PCR方法進行檢測，得到的cq值通過統(tǒng)計方法進行轉換，最終以△△CT形式進行統(tǒng)計分析做圖。

1.5細胞增殖活性檢測

收集各組細胞，將細胞置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時，離心棄掉上清液每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，持續(xù)培養(yǎng)4 h，離心棄上清，加入DMSO每孔100 μl，震蕩至結晶物充分溶解，采用全自動酶標儀檢測450 nm處吸光值(OD值)并做圖統(tǒng)計。

1.6統(tǒng)計學方法采用SPSS20.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，每組數(shù)據(jù)間采用獨立樣本T檢驗法分析數(shù)據(jù)，計量資料用均值±標準差(Mean±SD)表示，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1成纖維細胞輻照后JAG1及肺纖維化相關標志物表達情況

為確定JAG1是否與輻射誘導的纖維化相關，我們檢測了HLF細胞輻照后24 h、48 h、72 h后，JAG1、α-SMA、Collagen-1的蛋白和mRNA表達情況。通過以上檢測我們發(fā)現(xiàn)輻照后隨著時間的延長，JAG1蛋白表達逐漸增高與mRNA表達一致，(P<0.05)并具有統(tǒng)計學意義(見圖1A、B)。與此同時平滑肌動蛋白α-SMA和膠原蛋白1(Collagen-1)的蛋白與mRNA表達也升高(P<0.05)，與JAG1形成正相關。

(1A為Western Blot法檢測結果；1B為qPCR法檢測實驗結果)

2.2抑制成纖維細胞中的JAG1可抑制肺纖維化

為確定是否抑制JAG1可抑制輻射效應減弱肺纖維化，我們首先設計了JAG1基因的干擾片段(siRNA-JAG1),在三個干擾片段中，通過蛋白和mRNA表達水平的檢測我們選取了干擾效果最好的siJAG1-1片段(見圖2A、B)。在成纖維細胞中瞬時轉染JAD1的干擾片段24 h后對其進行10Gy的X射線輻照，結果顯示，與單獨輻照組相比，轉染+照射組α-SMA表達顯著下降，說明成纖維細胞并未被激活，沒有向肌成纖維細胞轉化，Collagen-1的表達同樣明顯被抑制，說明JAG1的抑制會減少細胞外基質(ECM)的過度堆積，從而緩解纖維化。

注：*P<0.05，與Control組相比較；#P<0.05，與10 Gy組相比較

2.3MTT法檢測細胞增殖

MTT結果顯示，輻照后細胞增殖活性顯著降低，轉染siJAG1-1后，活性明顯增強，說明抑制JAG1后可顯著提升成纖維細胞對X射線的輻射抗性，降低輻射對其影響(見圖3)。

圖3 各組細胞增殖活性比較

3 討論

近年來關于JAG1的研究主要集中在血液腫瘤方面，關于JAG1基因在肺纖維化中的研究鮮為人知。JAG1與Notch的結合可以調節(jié)細胞表型從而發(fā)揮生物學功能。同時JAG1可影響多條信號通路如TGF-β/Smads，Wnt/β-catenin，以及PI3K/AKT信號通路等[8-10]，這些信號通路多數(shù)均參與肺纖維化進程中的一部分。

我們目前的研究表明，JAG1的蛋白與肺纖維化重要標志物之間是負相關的。體外研究中發(fā)現(xiàn)，隨著輻照后時間的延長，成纖維細胞活化標志物α-SMA逐漸表達增強，表明輻照后成纖維細胞被活化，向肌成纖維細胞轉化[11]。隨后我們檢測了細胞外基質(ECM)中的主要成分Collagen-1，結果表明輻照后Collagen-1同樣呈逐漸增強趨勢，表明ECM大量集聚，最終產(chǎn)生了纖維化(見圖1)[12]。前期實驗證明JAG1與肺纖維化重要標志物呈正相關，說明JAG1參與到輻射誘導的肺纖維化過程中，為研究JAG1在肺纖維化中的具體作用，我們設計了JAG1的小分子RNA干擾片段，實驗證明干擾效果良好。隨后我們對成纖維細胞進行了JAG1的抑制，檢測發(fā)現(xiàn)，JAD1被抑制后肺纖維化標志物α-SMA、Collagen-1同樣被抑制。同時，JAG1抑制后可明顯降低輻射誘導的纖維化標志物的升高(見圖2)，說明JAG1在肺纖維發(fā)生過程中發(fā)揮了重要的促進作用，抑制JAG1可降低輻射效應，提高成纖維細胞的輻射抗性，阻止成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，并阻止ECM的聚集，從而緩解纖維化。接下來，為研究JAG1的降低是否對輻射導致成纖維細胞損傷產(chǎn)生影響，我們利用JAG1低表達的成纖維細胞進行輻照，檢測成纖維細胞的增殖活性。結果顯示，輻照可導致細胞損傷降低成纖維細胞增殖活性，而抑制JAG1后，成纖維細胞增殖活性顯著上升，表明JAG1可緩解輻射損傷，增強成纖維細胞的輻射抗性。至此我們得出結論，JAG1參與輻射誘導的肺纖維化過程，并且抑制JAG1可顯著降低輻射誘導的肺纖維化降低輻射對成纖維細胞的損傷。

綜上所述，抑制JAG1可調控肺纖維化過程，并降低輻射對成纖維細胞的損傷。但實驗仍有不足，輻照后成纖維細胞中JAG1是否會通過其他下游靶基因參與肺纖維化過程仍有待進一步深入研究。