豁痰解毒通絡(luò)方對SD大鼠頸總動脈球囊損傷后炎性因子表達的影響

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冠狀動脈粥樣硬化性心臟病簡稱冠心病(coronary heart disease，CHD)，其發(fā)病率逐年升高，經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)血管成形術(shù)(percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)后再狹窄(restenosis，RS)是影響冠狀動脈粥樣硬化性心臟病介入治療預(yù)后的關(guān)鍵問題。近年來，隨著藥物洗脫支架的研發(fā)及應(yīng)用，再狹窄呈下降趨勢。但藥物洗脫支架術(shù)后不可避免的支架內(nèi)再狹窄發(fā)生率仍達10%[1]，嚴重影響了遠期療效[2]是亟待解決的難題。探討再狹窄的發(fā)病機制，尋求防治再狹窄的有效方法，成為心血管領(lǐng)域的研究熱點和難點。多數(shù)中醫(yī)學者認為，再狹窄仍屬于中醫(yī)“胸痹”“真心痛”等范疇。鄧悅教授認為此病屬脈絡(luò)病，并提出“痰瘀伏絡(luò)”可能是其關(guān)鍵病機，針對此病因病機應(yīng)用豁痰解毒通絡(luò)方加減，在臨床應(yīng)用中效果顯著。本實驗主要觀察豁痰解毒通絡(luò)方對大鼠頸總動脈球囊損傷術(shù)后腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)的影響，為PTCA術(shù)后再狹窄的防治機制研究提供新思路。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 無特定病原體(SPF)級SD雄性大鼠，廠家：北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號：SCXK(京)2012-0001。體重380 g左右。

1.1.2 藥物及試劑 豁痰解毒通絡(luò)方組方：瓜蔞、金銀花、當歸、丹參等。中藥飲片購自北京同仁堂大藥房，在北京東直門醫(yī)院實驗室煎制；辛伐他汀(成都天銀制藥有限公司生產(chǎn))，批號：國藥準字H20083478；低分子肝素鈉(吉派林)(杭州九源基因工程有限公司生產(chǎn))，每瓶0.3 mL，批號：國藥準字H19990035；戊巴比妥(北京化學試劑公司生產(chǎn))，批號：020919；利多卡因(北京益民藥業(yè)有限公司生產(chǎn))，批號：H20083478；Trizol(總RNA抽提試劑)(美國Invitrogen公司生產(chǎn))，批號：1201320；異丙醇(美國Invitrogen 公司生產(chǎn))，批號：0942081；氯仿(美國Invitrogen 公司生產(chǎn))，批號：2573130；酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒(美國RD公司生產(chǎn))，批號：2014089；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司生產(chǎn))，批號：BBC0927A02。

1.1.3 實驗儀器 球囊導(dǎo)管、壓力泵(美國Medtronic 公司生產(chǎn))，球囊直徑為2 mm×20 mm；TGL-16B高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠生產(chǎn))；微波爐(格蘭仕有限公司生產(chǎn))，型號：EG1140H；DYCZ-24DN迷你雙垂直電泳槽(北京六一儀器廠生產(chǎn))；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(美國PERKIN ELMER生產(chǎn))，型號：GA9800；凝膠成像系統(tǒng)(美國自然基因科技有限公司生產(chǎn))。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型的建立 大鼠稱重，術(shù)前1 h于大鼠背部皮下注射吉派林，每只大鼠按500 U/kg注射；1%戊巴比妥鈉，40 mg/kg，腹腔注射，將麻醉好的大鼠固定于鼠板上，刮去頸部毛發(fā)，暴露頸部皮膚，用碘伏消毒，鋪蓋洞巾。沿頸正中線將頸部皮膚剪開，暴露頸部肌肉；將頸內(nèi)動脈遠心端結(jié)扎死，術(shù)后不需打開，將頸外動脈遠心端結(jié)扎；用動脈夾暫時阻斷頸總動脈近心端；在頸內(nèi)動脈遠心端用虹膜剪剪一V型切口，將球囊插入血管內(nèi)，松開動脈夾，將球囊近心端插入到盡量接近主動脈弓，但不要超過主動脈弓，大約4 cm長度；球囊遠端連接裝有生理鹽水的壓力泵，每次打入球囊的壓力一般為50.7 kPa～81.1 kPa(0.5 atm～0.8 atm)，打完壓力后，將球囊緩慢旋轉(zhuǎn)抽出至頸總動脈遠心端，將壓力減至0 kPa，反復(fù)3次后撤出球囊；結(jié)扎頸內(nèi)動脈近心端，解開之前在頸外動脈處打的結(jié)，恢復(fù)血流，縫合頸部皮膚，碘伏消毒傷口。假手術(shù)組只進行血管分離，不進行球囊擴張術(shù)。手術(shù)全程為無菌操作。

1.2.2 分組及給藥方法 將造模動物隨機分為模型組、中藥組、西藥組、中西藥組，造模后第2天開始灌胃給藥，模型組和假手術(shù)組給予生理鹽水同體積灌胃；中藥組給予豁痰解毒通絡(luò)方湯劑，按生藥16.33 g/(kg·d)給藥；西藥組給予辛伐他汀，按1.19 mg/(kg·d)給藥；中西藥組為以上兩種藥物合用，為確保給藥體積一致，進行了濃縮。每只大鼠給藥為每天100 g(1 mL)。全部大鼠普通飼料喂養(yǎng)。

1.2.3 取材及指標檢測方法 于術(shù)后第28天腹腔麻醉動物。①ELISA法標本取材：腹主動脈取血，常規(guī)離心獲得血清備用，用ELISA法檢測血清中炎性因子TNF-α、IL-6的表達。②RT-PCR反應(yīng)標本取材：取損傷側(cè)頸總動脈，放入無核糖核酸酶(RNA酶)的EP管中，在液氮中進行保存，用于PT-PCR法檢測頸總動脈組織中TLR4、IL-6的mRNA表達。所有檢測方法嚴格按照產(chǎn)品說明書操作。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6水平比較 模型組與假手術(shù)組比較，血清中TNF-α、IL-6的水平均升高(P<0.01)；中藥組、西藥組、中西藥組與模型組比較，血清中TNF-α、IL-6的水平均降低(P<0.05)。表明中藥組、西藥組、中西藥組都能夠抑制血清中TNF-α、IL-6的表達。詳見表1。

表1 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6水平比較(±s) ng/L

2.2 各組大鼠IL-6、TLR4基因表達水平比較 模型組與假手術(shù)組比較，IL-6 mRNA表達水平顯著升高(P<0.01)；中藥組、西藥組、中西藥組與模型組比較，IL-6 mRNA表達水平顯著降低(P<0.01)。表明中藥組、西藥組、中西藥組均能降低IL-6 mRNA的表達。詳見圖1、表2。 模型組與假手術(shù)組比較，TLR4 mRNA表達水平顯著升高(P<0.01)；中藥組、西藥組與中西藥組TLR4 mRNA表達水平較模型組降低(P<0.05或P<0.01)。表明中藥組、西藥組、中西藥組都能夠降低TLR4 mRNA的表達，中西藥組效果更顯著。詳見圖2、表2。

1：假手術(shù)組；2：模型組；3：中藥組；4：西藥組；5：中西藥組

1：假手術(shù)組；2：模型組；3：中藥組；4：西藥組；5：中西藥組

表2 各組IL-6 、TLR4 mRNA水平比較(±s)

3 討 論

目前大部分學者認為再狹窄的發(fā)生與血栓形成、血管彈性回縮及血管內(nèi)皮損傷、炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。再狹窄是血管損傷后一種過度的自我修復(fù)，由多種細胞因子、炎性因子組成的信號傳導(dǎo)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，促使血管平滑肌細胞增殖，向血管內(nèi)皮遷移，導(dǎo)致血管重塑，管腔變窄。大量研究表明，在再狹窄的發(fā)生發(fā)展進程中炎癥反應(yīng)發(fā)揮著重要作用。PTCA術(shù)后由于冠狀動脈內(nèi)膜的機械性損傷，引起血管內(nèi)皮功能受損，活化的內(nèi)皮細胞分泌多種黏附分子，促使白細胞與內(nèi)皮細胞的黏附及活化，活化的白細胞和內(nèi)皮細胞又可釋放一系列炎癥因子和趨化因子如TNF-α、IL- 6、白介素-8(IL-8)、TLR4等，一方面促進內(nèi)皮細胞損傷進一步增加上述黏附分子的表達，促進了再狹窄的發(fā)生；另一方面，可直接促進血管平滑肌細胞(VSMC)的增殖，促進內(nèi)膜增生、血管重塑以致再狹窄的形成[3-4]。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過球囊損傷的模型組TNF-α、IL-6、TLR4的含量顯著升高(P<0.01)，說明存在炎癥反應(yīng)的發(fā)生。中藥組、西藥組及中西藥組TNF-α、IL-6、TLR4的含量明顯降低，中西藥組則降低更明顯，說明辛伐他汀及豁痰解毒通絡(luò)方能夠干預(yù)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，而兩者合用效果更為顯著。

目前中醫(yī)學者認為PTCA術(shù)后再狹窄的病因病機主要有血瘀、痰瘀互結(jié)、毒瘀互結(jié)等，并進行了大量的臨床研究和實驗研究，為PTCA術(shù)后再狹窄的干預(yù)和治療開辟了新思路。有學者認為痰瘀伏絡(luò)為本病主要致病機制[5-8]，以此為切入點，探討PTCA術(shù)后再狹窄的發(fā)病機理，為本病的預(yù)防及治療提供了理論依據(jù)。痰瘀伏絡(luò)理論是在伏邪理論基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，伏邪理論最早見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，《素問·生氣通天論篇第三》曰：“冬傷于寒，春必溫病”。伏者，匿藏也。國醫(yī)大師任繼學教授指出：“伏邪即隱藏于人體之虛處”[9]。伏邪潛伏于人體正虛之處，指正氣不足時，邪氣未能及時清除，導(dǎo)致邪氣留戀，潛伏體內(nèi)，每遇外感六淫時邪，或七情內(nèi)傷，飲食勞倦等因素引動，便可觸發(fā)，或舊疾復(fù)發(fā)，或引發(fā)傳變。痰瘀伏絡(luò)理論是指痰瘀之邪，伏于血絡(luò)，痰瘀互結(jié)潛伏于絡(luò)脈。痰瘀伏絡(luò)是心血管疾病的重要發(fā)病機制，為心血管疾病的治療提供了重要靶標。根據(jù)痰瘀伏絡(luò)這一致病機制，提出豁痰解毒通絡(luò)方，方中包含瓜蔞、金銀花、當歸、丹參、水蛭等，以此方加減治療，臨床療效顯著[10]。本研究結(jié)果顯示，豁痰解毒通絡(luò)方能夠明顯降低TNF-α、IL-6、TLR4的表達，這些炎性因子又是很多炎性通路的重要分子?；硖到舛就ńj(luò)方能夠抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，進而抑制PTCA術(shù)后再狹窄的進程。常宏等[11]應(yīng)用益氣活血解毒方對大鼠頸總動脈球囊損傷后炎性因子表達的影響進行研究，結(jié)果顯示：益氣活血解毒方能夠降低C反應(yīng)蛋白(CRP)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)等炎性因子的表達，抑制新生內(nèi)膜的形成。

綜上所述，炎癥反應(yīng)在PTCA術(shù)后再狹窄進程中的作用備受關(guān)注，本實驗已經(jīng)證實炎性因子在大鼠頸總動脈球囊損傷后有明顯變化，而豁痰解毒通絡(luò)方能夠降低大鼠頸總動脈球囊損傷后炎性因子TNF-α、IL-6、TLR4的含量，進而抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生。由此證明，以痰瘀伏絡(luò)理論為基礎(chǔ)的組方用藥能夠減輕炎癥反應(yīng)，為中醫(yī)藥治療PTCA術(shù)后再狹窄提供了新思路。