精芪燕面方對自發(fā)高血壓大鼠血壓升高及心肌損傷的干預(yù)研究

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高血壓(hypertension)是以體循環(huán)動脈壓增高為主要表現(xiàn)，可伴有心、腦、腎等器官功能或器質(zhì)性損害的臨床綜合征，在臨床上有高致殘率和高致死率的特點[1]。而收縮壓/舒張壓(SBP/DBP)每降低10/5 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)可顯著減少所有主要心血管結(jié)局的相對風(fēng)險[2]。2017年11月14日美國心臟病學(xué)會(ACC)和美國心臟協(xié)會(AHA)聯(lián)合發(fā)布2017版高血壓臨床實踐指南，提出將高血壓的診斷從140/90 mmHg下降至130/80 mmHg，將目標(biāo)血壓降低病人的獲益將增大[3]。目前降壓藥物主要為5大類，但因多方面原因，高血壓控制率仍處于較低水平，患病率仍在持續(xù)上升[4]。高血壓的早期防治和長期防治戰(zhàn)略得到了學(xué)術(shù)界的共識，中醫(yī)藥作為輔助藥物治療高血壓，在調(diào)節(jié)機體整體平衡、控制血壓水平穩(wěn)定等方面體現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢[5]，在平穩(wěn)降壓的同時，能夠有效改善眩暈、頭痛等臨床癥狀，并減少并發(fā)癥的發(fā)生，同時長期防治中藥物的副作用也是一個主要的障礙，因此藥食同源中藥研究是應(yīng)對高血壓長期防治的優(yōu)勢途徑，目前中醫(yī)臨床探索較多，但深入細致的研究缺乏。作為藥食同源的中醫(yī)藥處方，有潛在心肌保護作用。本研究選擇自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)，觀察精芪燕面方(JQYM)在降低SHR血壓的同時，對行為學(xué)表現(xiàn)(旋轉(zhuǎn)耐受時間)及心臟組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、鈉尿肽(ANP)mRNA表達水平及心肌損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級4周齡SHR和Wistar-Kyoto(WKY)雄性大鼠，購自北京維通利華有限公司。

1.2 藥物與試劑 精芪燕面方所含中藥材購自上?？禈蛑兴庯嬈邢薰荆合目莶?批號161114)、黃芪(批號161207)、制黃精(批號161201)、桑葉(批號161101)、生山楂(批號161022)；坎地沙坦酯片(8 mg)：國藥準(zhǔn)字J20150085， 日本武田藥品工業(yè)株式會社生產(chǎn)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：日本Takara，寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)；SYBR Green 熒光染料：瑞士Roche公司生產(chǎn)。

1.3 主要儀器 智能無創(chuàng)血壓計BP-98A Series[北京軟隆(Softron)生物技術(shù)有限公司]；平衡旋轉(zhuǎn)儀(JD-01GSZ型，上海繼德教學(xué)實驗器材廠)；自動脫水機，石蠟包埋機，石蠟切片機及正置顯微鏡(LEICA)；PCR定量測試儀(Eppendorf)；實時熒光定量PCR系統(tǒng)(Light Cycler RL 480II Roche)。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗分組 采用4周齡SHR雄性大鼠36只為實驗動物，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為SHR模型組，中藥治療組(JQYM組)、坎地沙坦酯片組(Can組)，每組各12只。以同周齡WKY雄性大鼠12只為正常對照組。所有動物均飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院動物實驗中心，并均給予標(biāo)準(zhǔn)化飲食，不限其活動，維持其飼養(yǎng)溫度及相對濕度以保證飼養(yǎng)環(huán)境。

1.4.2 給藥方式及劑量 JQYM組、Can組于6周齡時分別灌服精芪燕面方、坎地沙坦酯片；SHR模型組與正常對照組則灌胃等劑量的飲用水。所有實驗動物飼養(yǎng)至20周齡。Can組所用坎地沙坦酯采用pH值為6.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解，按照人體劑量換算以1 mg/kg的劑量灌胃，每次2 mL，每日1次；JQYM組大鼠用量按人體用量6.3倍換算給藥，稱取相應(yīng)草藥(夏枯草30 g，黃芪30 g，制黃精15 g，桑葉15 g，生山楂15 g)，使用自動煎藥鍋進行煎煮，煎煮后取藥汁，按每只大鼠灌胃2 mL計算所需藥汁總量，進行加熱濃縮定量。

1.4.3 血壓測量 所有實驗動物每2周測量其收縮壓及舒張壓水平。所有待測血壓動物，當(dāng)日09:00灌胃，測量灌胃后1 h血壓。測量過程完全嚴格按血壓計操作手冊規(guī)范進行操作，首先將測量裝置連接好并開啟保溫裝置，溫度控制在37.0 ℃～38.5 ℃。然后將大鼠放在保溫裝置中固定并預(yù)熱約15 min后，開始測量大鼠安靜清醒狀態(tài)尾動脈收縮壓，連續(xù)測量3次取其平均值，正式測量血壓之前每天進行測量血壓訓(xùn)練，連續(xù)訓(xùn)練7 d[6]。

1.4.4 旋轉(zhuǎn)耐受時間測量 對大鼠的平衡耐受時間進行測量，把大鼠安置在轉(zhuǎn)速為60 r/min的旋轉(zhuǎn)平臺之上，觀察大鼠自旋轉(zhuǎn)到跌落平臺的時間并進行記錄，2 min后，若大鼠仍然在平臺上，就停止測試，所有大鼠的測試時間統(tǒng)一規(guī)定在10:00～11:00。觀察大鼠掉落平臺時間來判斷大鼠的旋轉(zhuǎn)耐受時間。

1.4.5 心臟組織蘇木素-伊紅(HE)染色 所有實驗動物均于最后一次灌胃測壓后，次日腹腔注射10%的水合氯醛麻醉，解剖取材。每組隨機選取6只大鼠，取心臟組織，用4%多聚甲醛固定，24 h后自動脫水機脫水、石蠟包埋。主要采用石蠟切片，HE染色，顯微鏡下觀察病理形態(tài)的變化。大鼠心臟病理切片，每隔10張選取1張進行HE染色，顯微拍攝，評分。

1.4.6 心肌細胞肥大評價 每只動物每張病理切片，選擇病變部位附近30個～50個心肌細胞，使用Leica Qwin V3分析軟件計算每個心肌細胞的橫截面積，取其平均值以代表該實驗動物的心肌細胞橫截面面積，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.4.7 RNA抽提及TNF-α、ANP表達檢測 每組取6只大鼠心臟組織靠近心尖部下1/3予以檢測TNF-α及ANP mRNA相對表達。β-actin作為內(nèi)參，β-actin 引物：上游5′CACCCGCGAGTACAACCTTC 3′，下游5′CCCATACCCACCATCACACC 3′；TNF-a 引物：上游5′ACAAGGAGGAGAAGTTCCCAAAT 3′，下游5′CTTGTCACTCGAGTTTTGAGAAGA 3′；ANP引物：上游5′CTGGGACCCCTCCGATAGAT 3′ ，下游5′ TTCGGTACCGGAAGCTGTTG 3′。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠收縮壓變化情況 與正常對照組比較，SHR模型組收縮壓隨著周齡的增加，其收縮壓持續(xù)上升。與SHR模型組比較，Can組收縮壓顯著降低(P<0.05)。與SHR模型組比較，JQYM組灌胃4周后(8周齡)開始有顯著降壓作用，一直到20周齡，持續(xù)穩(wěn)定發(fā)揮控壓作用(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠收縮壓變化情況(±s) mmHg

2.2 各組大鼠舒張壓變化情況 與正常對照組比較，SHR模型組舒張壓顯著升高。與SHR模型組比較，Can組舒張壓水平顯著降低(P<0.05)；JQYM組于第14周齡、18周齡、20周齡時，舒張壓水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 詳見表2。

表2 各組大鼠舒張壓變化情況(±s) mmHg

2.3 各組大鼠旋轉(zhuǎn)耐受時間比較 與正常對照組比較，SHR模型組旋轉(zhuǎn)耐受時間縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Can組旋轉(zhuǎn)耐受時間與SHR模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。JQYM組旋轉(zhuǎn)耐受時間較SHR模型組、Can組顯著延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖1。

與SHR模型組比較，*P<0.05；JQYM組與Can組比較，△P<0.05

2.4 各組大鼠心肌損傷程度比較 高倍鏡下，正常對照組心肌組織未見明顯病理性改變；SHR模型組可見心肌組織多發(fā)性灶性壞死，大量炎性細胞浸潤；JQYM組僅見少量的炎性細胞浸潤，且對心肌組織的保護作用優(yōu)于SHR模型組。詳見圖2。根據(jù)心肌損傷受累面積、損傷程度等，分別標(biāo)記為“-”“-/+”“+”“++”“+++”“++++”，其中“-”代表無明顯損傷，“++++”則為存在極重度損傷。與SHR模型組比較，JQYM組與Can組心肌損傷程度顯著降低(P<0.05)。詳見表3。

圖2 各組大鼠心肌組織病理性改變

表3 20周齡各組大鼠心肌損傷評分

2.5 各組大鼠心肌細胞橫截面面積比較 為進一步探索JQYM對高血壓心臟保護效應(yīng)的研究，在高倍鏡下分別選取30個～50個心肌細胞，使用Leica Qwin V3分析軟件計算每個心肌細胞的橫截面積，進行統(tǒng)計分析。與正常對照組比較，SHR模型組大鼠心肌組織平均橫截面面積顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與SHR模型組比較，Can組及JQYM組心肌橫截面面積顯著降低(P<0.05)，且JQYM組較Can組降低更明顯(P<0.05)。詳見圖3、圖4。

圖3 各組大鼠心肌細胞橫截面面積

與SHR模型組比較，*P<0.05；JQYM組與Can組比較，△P<0.05

2.6 各組大鼠心臟組織TNF-α及ANP mRNA表達水平比較 分別將正常對照組大鼠心臟組織中TNF-α及ANP mRNA表達量標(biāo)準(zhǔn)化為1。與正常對照組比較，SHR模型組大鼠心臟組織中TNF-α及ANP mRNA相對表達量均顯著上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與SHR模型組比較，Can組和JQYM組心臟組織中TNF-α及ANP mRNA相對表達量均顯著下調(diào)(P<0.05)；且JQYM組較Can組TNF-α及ANP mRNA表達降低明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖5、圖6。

與SHR模型組比較，*P<0.05；與正常對照組比較，#P<0.05；JQYM組與Can組比較，△P<0.05

與SHR模型組比較，*P<0.05；SHR模型組與正常對照組比較，#P<0.05；JQYM組與Can組比較，△P<0.05

3 討 論

高血壓屬于中醫(yī)學(xué)“眩暈”“頭痛”等病證范疇，張騰教授認為早中期高血壓病變主要在肝，治療應(yīng)注重隨證從肝論治，重在清肝益腎祛風(fēng)，通過在臨床長期治療大量高血壓病總結(jié)出該法則有效。本研究在前期臨床及動物實驗結(jié)果得出清肝益腎祛風(fēng)法則組合的方藥不僅能降低血壓，而且能夠保護心、腦、腎靶器官損傷，改善臨床癥狀，提高生活質(zhì)量，取得較好的臨床效果[7-8]。本課題組為進一步推廣中醫(yī)藥防治高血壓病，以清肝益腎祛風(fēng)為組方精髓，選擇藥食同源的中藥組合成精芪燕面方(夏枯草30 g，黃芪30 g，制黃精15 g，桑葉15 g，生山楂15 g)。夏枯草又名燕面(《別錄》)，具有清肝火明目[9]；黃芪與制黃精益氣養(yǎng)陰益腎[10-11]；桑葉輔助祛風(fēng)清肝[12]；生山楂消食健胃，行氣散瘀[13]，諸藥組合為藥食同源方并選擇自發(fā)性高血壓大鼠進行動物實驗以期獲得更充實的數(shù)據(jù)為其推廣和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。SHR是目前國際公認最接近于人類原發(fā)性高血壓的動物模型，是基礎(chǔ)研究及藥物篩選的首選[14]。除了血壓值指標(biāo)外，本研究納入旋轉(zhuǎn)耐受時間這一指標(biāo)。通過實驗研究提示精芪燕面方能顯著延長旋轉(zhuǎn)耐受時間，且顯著優(yōu)于坎地沙坦，在證實了其穩(wěn)定的降壓作用基礎(chǔ)上又突顯了中藥改善癥狀的優(yōu)勢作用。TNF-α是一種促炎性細胞因子，主要由巨噬細胞、CD4淋巴細胞、自然殺傷細胞激活，可促進白介素-1(IL-1)和白介素-6(IL-6)的釋放，加重高血壓進展。本研究發(fā)現(xiàn)JQYM可顯著降低SHR大鼠心肌組織中TNF-α水平，提示JQYM降壓的作用可能與降低心肌組織中TNF-α的水平，進而改善炎癥水平有關(guān)。ANP是一類由心房肌細胞合成、釋放，在正常生理情況下處于低表達狀態(tài)的肽類激素。在病理情況下，或因機械損傷或因高血壓容量狀態(tài)下，心房肌釋放ANP增加。本研究結(jié)果顯示，JQYM降低SHR大鼠心臟組織中ANP表達，可能與其顯著改善心肌損傷的作用有關(guān)。

綜上所述，JQYM對SHR大鼠有顯著降壓作用，雖然降壓水平不及坎地沙坦酯片，但作用穩(wěn)定持久，且其對SHR大鼠所致的心肌損傷保護作用優(yōu)于坎地沙坦酯片。高血壓及其靶器官損傷是危害人類健康的最主要隱形殺手，防治工作具有長期性、持久性，藥食同源處方以其安全第一且作用穩(wěn)定的巨大優(yōu)勢一定會發(fā)揮其積極作用，為人類健康事業(yè)做出貢獻。