N—乙酰半胱氨酸對(duì)煙霧吸入大鼠急性肺損傷的療效觀察

王文迪 李小兵 劉光晶

摘 要：目的 觀察N-乙酰半胱氨酸對(duì)煙霧吸入所致大鼠急性肺損傷的治療效果。方法 將健康雄性大鼠108只隨機(jī)分為空白對(duì)照組、損傷對(duì)照組、NAC低、中、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組，每組各18只。除空白對(duì)照組外其余各組均制作煙霧吸入性急性肺損傷模型。NAC低、中、高劑量組分別于傷后2 h給予大鼠腹腔注射NAC 100、200、300 mg/kg，陽(yáng)性對(duì)照組于傷后2 h給予大鼠腹腔注射地塞米松10 mg/kg，損傷對(duì)照組模型成功后不予處理。比較6組大鼠血?dú)夥治銮闆r，采用免疫組化法檢測(cè)大鼠肺組織NF-kB（p56）及IkB-α的活性，放射免疫分析法測(cè)定大鼠肺組織勻漿中TNF-α及IL-6的含量，計(jì)算大鼠肺系數(shù)和肺濕干重比。光鏡下觀察大鼠肺組織病理改變、透射電子顯微鏡觀察肺組織亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變。結(jié)果 血?dú)夥治鼋Y(jié)果顯示，NAC低、中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組與損傷對(duì)照組比較，各指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中PaO2，SaO2及BE值均上升，PaCO2，HCO3-下降（P<0.05）；NAC低、中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組與損傷對(duì)照組比較，肺組織TNF-α及IL-6的含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；NAC低、中、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組與損傷對(duì)照組比較，PWI和W/D均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；NAC低、中、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組與損傷對(duì)照組相比，NF-kB（p56）在細(xì)胞核及胞漿中的陽(yáng)性反應(yīng)減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；損傷對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，IkB-α呈強(qiáng)陽(yáng)性免疫反應(yīng)，陽(yáng)性免疫反應(yīng)產(chǎn)物分布在陽(yáng)性細(xì)胞的胞漿中，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。NAC低、中、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組與損傷對(duì)照組相比，IkB-α在胞漿中的陽(yáng)性反應(yīng)減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 N-乙酰半胱氨酸對(duì)大鼠煙霧吸入所致急性肺損有保護(hù)作用，能夠減輕大鼠肺水腫及炎癥反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：吸入性損傷；乙酰半胱氨酸；肺；腫瘤壞死因子；炎癥反應(yīng)；地塞米松

中圖分類號(hào)：R563 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.23.027

文章編號(hào)：1006-1959（2018）23-0101-04

Abstract：Objective To investigate the therapeutic effects of N-Acetylcysteineon smoke inhalation-induced acute lung injury in rats.Methods 108 healthy male rats were randomly divided into control group， injury control group， low， middle and high NAC groups， and positive control group （18 rats in each group）.The model of acute lung injury induced by smoke inhalation was made in all groups except the blank control group.The rats in the low， middle and highNAC groups were given intraperitoneal injection of NAC 50，100，150 mg/kg 2 h after injury. The rats in the control group were given 10 mg/kg of dexamethasone 2 h after injury.The model of injury control group was not treated after successful construction.Comparison of blood gas analysis in 6 groups of rats was made，the activities of NF-kB（p56） and IkB-α in rat lung tissue were detected by immunohistochemical method.The contents of TNF-α and IL-6 in the lung homogenate of rats were measured by radioimmunoassay， and the lung coefficient and lung wet dry weight ratio were calculated.Then the pathological changes of lung tissue were observed under light microscope and the changes of subcellular structure in lung tissue were observed by transmission electron microscope （TEM）.Results The results of blood gas analysis showed that there were significant differences between the low， middle and high doses of NAC and the positive control group compared with the injured control group （P<0.05）.PaO2，SaO2 and BE both increased and PaCO2，HCO3- decreased （P<0.05）.The contents of TNF-α and IL-6 in lung tissue decreased in low， medium and high dose of NAC and positive control group （dexamethasone） compared with the injured control group，the difference was statistically significant （P<0.05）.Compared with the injured control group， PWI and W/D decreased significantly in the low， middle and high dose groups of NAC and the positive control group，the difference was statistically significant （P<0.05）.Compared with the injured control group， the positive reaction of NF-kB（p56） in the nucleus and cytoplasm was decreased in the low， medium and high dose groups of NAC， and the positive reaction in the positive control group was lower than that in the injured control group，the difference was statistically significant （P<0.05）.Compared with the control group， IkB-α showed strong positive immunoreactivity， and the positive immunoreactive products were distributed in the cytoplasm of the positive cells，the difference was statistically significant（P<0.05）.The positive reaction of IkB-α in cytoplasm of the low， middle and high dose groups of NAC and the positive control group was significantly lower than that of the injured control group，the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion N- acetylcysteine has protective effect on acute lung injury induced by smoke inhalation in rats and can alleviate pulmonary edema and inflammation in rats.

Key words：Inhalation injury；Acetylcysteine；Lung；Tumor necrosis factor；Inflammatory reaction；Dexamethasone

煙霧吸入性損傷常發(fā)生于不通風(fēng)或密閉的環(huán)境中，包括熱力損傷和煙霧損傷，熱力損傷主要是吸入大量干熱和濕熱的空氣導(dǎo)致呼吸道、肺實(shí)質(zhì)損傷，煙霧損傷主要是吸入大量炭粒和化學(xué)物質(zhì)，導(dǎo)致呼吸道、肺實(shí)質(zhì)化學(xué)性損傷，煙霧吸人性損傷的發(fā)病率和病死率都很高[1]。大面積燒傷合并吸入性損傷是指患者發(fā)生嚴(yán)重?zé)齻耐瑫r(shí)，因吸入有毒煙霧或燒傷性化學(xué)物質(zhì)而導(dǎo)致呼吸道受到化學(xué)性損傷，情況嚴(yán)重者甚至損傷肺實(shí)質(zhì)。燒傷合并吸入性損傷約占燒傷患者總數(shù)的5%～10%，重度吸入性損傷的病死率可高達(dá)80%，是燒傷三大致死原因之一[2]。目前臨床對(duì)煙霧吸入所致急性肺損傷治療有針對(duì)性的藥物不多，主要以清除分泌物和氣道盥洗等機(jī)械性治療為主[3]。N-乙酰半胱氨酸是一種痰液裂解劑，對(duì)多種呼吸道疾病如慢性阻塞性肺疾病、肺間質(zhì)纖維化、急性肺部感染有一定療效[4]，但對(duì)吸入性損傷的治療效果罕見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)對(duì)N-乙酰半胱氨酸治療吸入性損傷大鼠的治療效果進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選自天津市第一中心醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠SPF級(jí)108只，體重200～250 g，平均體重（220.30±11.00）g，喂養(yǎng)于光照12 h、相對(duì)濕度40%～60%、溫度23～25 ℃、自由進(jìn)食水的環(huán)境中。儀器包括BP-6動(dòng)物無創(chuàng)血壓檢測(cè)儀、BL420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)設(shè)備、醫(yī)用離心機(jī)、Olympus光學(xué)顯微鏡、TP-100型電子天平、CG-1200γ放射免疫計(jì)數(shù)器、微量移液器。

1.2方法

1.2.1模型建立及實(shí)驗(yàn)分組 將SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分成6組，每組18只，分別為空白對(duì)照組、損傷對(duì)照組、NAC低、中、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組?？瞻讓?duì)照組常規(guī)飼養(yǎng)不作處理，余5組以腹腔注射水合氯醛300 mg/kg麻醉后，參照文獻(xiàn)[5]制作煙霧吸入性急性肺損傷模型。其中損傷對(duì)照組模型制作成功后不作處理，NAC低、中、高劑量組分別于造模后2 h腹腔推注NAC 100、200、300 mg/kg。陽(yáng)性對(duì)照組于造模后2 h腹腔推注地塞米松10 mg/kg。傷后4 h給予20%烏拉坦10 ml/kg腹腔麻醉，肝素抗凝。開胸于左心室采血測(cè)動(dòng)脈血?dú)?，肉眼觀察肺組織被膜、腫大及淤血程度等病理改變；摘取右肺組織洗干表面水分，稱取100 mg右肺組織置于勻漿器，加入3倍體積磷酸鹽緩沖液，冰浴勻漿，離心后取上清液使用放免試劑盒檢測(cè)TNF-α及IL-6的含量。右肺剩余組織測(cè)定肺系數(shù)（PWI=肺重/體重×100%）和肺濕/干重比（W/D）；取左肺組織用免疫組化法檢測(cè)NF-kB（p56）及IkB-α的活性。

1.2.2免疫組化染色及結(jié)果判定 陽(yáng)性細(xì)胞百分比按視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞所占總細(xì)胞數(shù)≤25%，26%～50%，51%～75%，≥75%分別計(jì)為0，1，2，3，4分。按陽(yáng)性細(xì)胞著色無、弱（淡黃）、中（棕黃）、強(qiáng)（棕褐）分別計(jì)為0，1，2，3分。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：以上2種計(jì)分結(jié)果相加，0分為-，2～3分為+，4～5分為++，6～7分為+++。每張切片隨機(jī)隨機(jī)取5個(gè)400倍視野，每個(gè)視野均進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分與著色強(qiáng)度計(jì)分，5個(gè)視野計(jì)分的平均值為改切片的最后得分。

1.2.3 HE染色 常規(guī)脫水、包埋、切片、染色，染色過程中將HE充分利用起來，400倍光學(xué)顯微鏡下對(duì)大鼠分組織進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)觀察。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用（x±s）表示，行t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 6組大鼠血?dú)夥治霰容^ NAC低、中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組與損傷對(duì)照組各指標(biāo)比較，其中PaO2，SaO2及BE值均上升（P<0.05），PaCO2，HCO3-均下降（P<0.05），見表1。

2.2肺組織TNF-α及IL-6含量比較 損傷對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，肺組織TNF-α及IL-6含量上升（P<0.05）；NAC低、中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組與損傷對(duì)照組比較，肺組織TNF-α及IL-6含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.3肺系數(shù)和肺濕/干重比變化比較 NAC低、中、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組與損傷對(duì)照組比較，PWI和W/D均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；NAC低劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表3。

2.4肺組織NF-kB（p56）及IkB-α活性比較 NF-kB（p56）呈強(qiáng)陽(yáng)性免疫反應(yīng)，陽(yáng)性免疫反應(yīng)產(chǎn)物不僅分布在陽(yáng)性細(xì)胞的胞漿中，細(xì)胞核中陽(yáng)性蛋白表達(dá)也呈強(qiáng)陽(yáng)性，可見明顯的細(xì)胞核移位，表面NF-kB（p56）已活化，按判定標(biāo)準(zhǔn)計(jì)分原則比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。NAC低、中、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組與損傷對(duì)照組相比，NF-kB（p56）在細(xì)胞核及胞漿中的陽(yáng)性反應(yīng)減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。損傷對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，IkB-α呈強(qiáng)陽(yáng)性免疫反應(yīng)，陽(yáng)性免疫反應(yīng)產(chǎn)物分布在陽(yáng)性細(xì)胞的胞漿中，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。NAC低、中、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組與損傷對(duì)照組相比，IkB-α在胞漿中的陽(yáng)性反應(yīng)減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表4。

2.5肺組織病理學(xué)檢查 空白對(duì)照組肺組織表面及鏡下病理學(xué)未見異常，見圖1。損傷對(duì)照組肺組織膨大、淤血，肺組織表面可見大小不等的暗紅色斑點(diǎn)狀病灶，被摸光亮、濕潤(rùn)。鏡下肺泡壁破壞嚴(yán)重，肺泡隔增厚，肺間質(zhì)及肺泡腔嚴(yán)重水腫、滲出及出血，大量粒細(xì)胞浸潤(rùn)及透明膜形成，見圖2。而應(yīng)用NAC治療的各組肺組織相對(duì)損傷對(duì)照組隨計(jì)量增加體積膨大程度、淤血、暗紅色程度依次減輕，NAC高劑量組可見光鏡下肺泡壁多數(shù)完整，肺泡隔較陽(yáng)性對(duì)照組明顯變窄。腔內(nèi)少許出血、滲出及細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖3。

3 討論

吸入性損傷患者預(yù)后與其伴發(fā)的肺部嚴(yán)重炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。吸入性損傷發(fā)生時(shí)，由于缺血、物理化學(xué)刺激等因素，大量中性粒細(xì)胞聚集于肺部，并伴隨抗氧化酶的大量消耗。中性粒細(xì)胞可分泌TNF-α及IL-6等多種炎癥因子。炎癥因子的聚集和激活是引起肺部毛細(xì)血管和肺泡損傷的主要原因之一，往往誘發(fā)廣泛而劇烈的肺局部組織炎癥反應(yīng)和急性呼吸功能障礙。NF-kB是細(xì)胞中的一種快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，細(xì)胞在靜息狀態(tài)時(shí)，NF-kB（p56）與其抑制蛋白結(jié)合，以無活性的狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞損傷受刺激后，NF-kB（p56）再?gòu)募?xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，與NF-kB（p56）形成二聚體，它的激活轉(zhuǎn)錄可導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞及肺泡巨噬細(xì)胞等釋放大量促炎性細(xì)胞因子，介導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[6]。本研究顯示大鼠經(jīng)煙霧吸入致急性肺損傷后，PaO2，SaO2及BE值均顯著下降；PaCO2，HCO3-均上升，組織進(jìn)入強(qiáng)烈的缺氧狀態(tài)。同時(shí)肺組織TNF-α及IL-6的含量顯著上升，NF-kB（p56）和IkB-α免疫組化呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，與相關(guān)報(bào)道一致[7]。

NAC是左旋精氨酸的天然衍生物，分子內(nèi)含有活性的SH基團(tuán)，能將痰液中黏蛋白的二硫鍵（SS）裂斷，使黏蛋白分解，降低痰的粘滯性。NAC還可刺激呼吸道纖毛運(yùn)動(dòng)，刺激胃肺迷走神經(jīng)反射，從而促進(jìn)黏液的清除。氧化物的增加及抗氧化物的減少與吸入性損傷發(fā)病過程密切相關(guān)，而NAC本身就是一種直接的抗氧化物，能清除羥自由基（OH）、過氧化氫以及次氯酸等。有研究表面，NAC能抑制TNF-α的激活，阻斷炎前性細(xì)胞因子的啟動(dòng)，從而阻斷上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子。此外，NAC還能通過抑制過氧化氫對(duì)肺泡上皮細(xì)胞NF-kB的活化，減少IL-6的產(chǎn)生與表達(dá)，抑制中性粒細(xì)胞在肺的聚集[8]。王雯等研究表明，霧化吸入NAC能有效緩解患者咳嗽及呼吸困難癥狀，顯著改善患者動(dòng)脈血氧分壓等[9]。筆者課題組在應(yīng)用NAC治療煙霧吸入所致大鼠急性肺損傷模型中觀察到，NAC可以明顯提升動(dòng)脈血氧含量，改善肺組織干濕重比，從而減輕了肺水腫。

本研究結(jié)果表明，NAC能夠有效的抑制相關(guān)炎癥因子的釋放，使中性粒細(xì)胞在肺部聚集、活化減少，降低了氧自由基的產(chǎn)生，具有明顯的抗炎作用。提高NAC的給藥劑量至本次研究中所用高劑量（300 mg/kg）后保護(hù)效果明顯增強(qiáng)，表明NAC對(duì)吸入性肺損傷的保護(hù)作用與其在體內(nèi)生成還原性物質(zhì)的數(shù)量有一定關(guān)系。

綜上所述，N-乙酰半胱氨酸對(duì)大鼠煙霧吸入所致急性肺損有保護(hù)作用，能夠有效減輕大鼠肺水腫及炎癥反應(yīng)。

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收稿日期：2018-9-27；修回日期：2018-10-17

編輯/成森