黃芪提取物對(duì)大鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊及血清 SDF-1、CXCR4、VEGF 的影響*

周鳳軍 付 鵬 張 鑫 牛榮榮 劉 娜 王鴻章 王玲玲

（河北省邯鄲市中醫(yī)院，河北 邯鄲 056001）

近年來，我國心腦血管疾病發(fā)病率逐年升高。頸動(dòng)脈粥樣硬化是頸動(dòng)脈血管的一種動(dòng)態(tài)的、持續(xù)性、進(jìn)展性的病理性病變，其常見的病理變化為頸動(dòng)脈內(nèi)膜增厚和粥樣物質(zhì)斑塊的形成［1-2］。血清基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）是由骨髓細(xì)胞產(chǎn)生的一種趨化蛋白，對(duì)單核細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞的遷移具有明顯誘導(dǎo)作用。趨化因子受體-4（CXCR4）是SDF-1的受體，與SDF-1結(jié)合后形成同源二聚體，刺激平滑肌細(xì)胞增殖并向內(nèi)膜下遷移，進(jìn)而損傷內(nèi)皮細(xì)胞，暴露膠原組織，誘導(dǎo)血小板聚集和活化，加劇動(dòng)脈粥樣硬化［3-4］。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）具有促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)變性、血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖的作用，與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)［5］。黃芪提取物有效成分為黃芪甲苷，黃芪多糖等，具有破血行瘀。益氣養(yǎng)陰、舒張外周血管阻力的功效［6］。本研究擬探討黃芪提取物對(duì)大鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊及血清SDF-1、CXCR4、VEGF的影響，為頸動(dòng)脈粥樣硬化的治療提供理論及臨床依據(jù)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠120只，12周齡，體質(zhì)量（117.79±10.23）g，許可證號(hào)：SCXK（渝）2014-0002。由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 試藥與儀器 黃芪（河北產(chǎn)，批號(hào)：07124018），制作工藝為：黃芪適度粉碎。按1∶20料液比加入70%乙醇浸泡24 h，70℃水浴加熱回流提取，每次加熱2 h，共4次。提取液趁熱過濾，藥渣按1∶20料液比加入蒸餾水，加熱2 h，提取溫度保持在70℃，回流提取4次，最后將提取液合并濃縮，每克黃芪提取物濃縮液相當(dāng)于生藥5.14 g。將濃縮液溶入蒸餾水，根據(jù)成人劑量公式換算，大鼠用藥量為成人的20.13倍，以10.0 mL/kg體質(zhì)量灌胃，將藥液濃度配制成為10.0 g/mL。SDF-1、CXCR4、VEGF Elisa 試劑盒（批號(hào)：KIT130986-4、KIT132097-4、KIT109871-2）購于上海廣銳生物科技有限公司，北京普天多功能酶標(biāo)儀PT-3502A，SD-1700彩色超聲儀、奧林巴斯全自動(dòng)生化儀AU-480。

1.3 分組與造模 根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分成6組：對(duì)照組、模型組、阿托伐他汀組、黃芪提取物高劑量組（8.0 mg/kg）、黃芪提取物中劑量組（4.0 mg/kg）、黃芪提取物低劑量組（2.0 mg/kg），每組20只，雌雄各半，飼養(yǎng)環(huán)境符合SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)條件要求。動(dòng)物自由攝取飼料、自由飲水，自動(dòng)控制晝夜循環(huán)（12/12 h），室溫（22±1）℃。每周稱質(zhì)量1次，每周調(diào)換籠位1次。模型組、阿托伐他汀組、黃芪提取物各劑量組：實(shí)驗(yàn)前10周，予以各組大鼠高脂飼料（70%基礎(chǔ)飼料，10%蛋黃、13%豬油、1%膽固醇、2%3號(hào)膽鹽酸、1%丙硫氧嘧啶、3%吐溫-80℃）喂養(yǎng)，并一次性腹腔注射維生素D3注射液60萬U/kg。對(duì)照組喂以普通飼料。各組給藥方法：根據(jù)預(yù)試驗(yàn)獲得大鼠黃芪提取物的藥物半數(shù)有效量（ED）約為320.0 mg/kg，取大鼠黃芪提取物ED的1/4（80.0 mg/kg）、1/8（40.0 mg/kg）、1/16（20.0 mg/kg）作為黃芪提取物高劑量組、黃芪提取物中劑量組、黃芪提取物低劑量組，連續(xù)灌胃8周，每周記錄體質(zhì)量，調(diào)節(jié)并維持給藥量；阿托伐他汀組給予等體積的阿托伐他汀注射液灌胃（30.0 mg/kg），對(duì)照組給以同等體積的蒸餾水灌胃，干預(yù)8周。

1.4 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，仰臥位固定大鼠于平板上，SD-1700彩色超聲儀測(cè)量頸動(dòng)脈血管內(nèi)膜（IMT）、頸動(dòng)脈血管中膜（MT），頸部側(cè)伸 45°，取頸動(dòng)脈長軸切面，測(cè)量頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈起始端管腔內(nèi)膜交界面到內(nèi)膜與外膜交界處之間的垂直距離，位置為雙側(cè)頸總動(dòng)脈、頸動(dòng)脈分叉處，連續(xù)測(cè)量3個(gè)心動(dòng)周期，取其平均值為IMT、MT。2）股動(dòng)脈取血5 mL置于無菌非抗凝管中，3 000 r/min離心10 min，收集上清液，奧林巴斯AU-480測(cè)定血清三酰甘油（TAG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平。3）多功能酶標(biāo)儀PT-3502A檢測(cè) SDF-1、CX-CR4、VEGF水平，具體方法為：取100 μL血清加入到相應(yīng)的微孔中，在37℃孵育2 h，每孔中100 μL的檢測(cè)抗體稀釋液（綠色），用膠帶密封微孔板后37℃孵育1 h，漂洗微孔，加入酶標(biāo)抗體：每孔加入100 μL的辣根過氧化物酶標(biāo)抗體稀釋液（紅色），用膠帶密封微孔板后37℃孵育30 min，重復(fù)漂洗操作過程。加入100 μL底物液（分別含 SDF-1、CX-CR4、VEGF） 在 37℃放置10 min，每孔加入終止液 100 μL（2 M H2SO4）終止反應(yīng)，于 450、465、492 nm 檢測(cè) OD 值。4）處死大鼠后，手術(shù)切取雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈2 cm處，常作HE染色觀察病理變化。具體方法：石蠟包塊與二甲苯中脫蠟5～10 min，換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5～10 min，無水乙醇5 min，90%乙醇2 min，70%乙醇2 min，蒸餾水2 min。制作5 μm切片，制作好的切片于蘇木素染色液5 min，浸自來水中沖洗去多余的染色液，10 min后，蒸餾水再洗滌1遍，95%乙醇5 s，伊紅染色液染色1 min。5）三色（MASSON）染色測(cè)定股動(dòng)脈膠原面積（CA）、血管橫截面積（CVA），具體方法為：常規(guī)制作 5 μm 切片，將制作好的切片規(guī)脫蠟至蒸餾水，置于麗春紅酸性品紅液中染2 min，放入0.2%冰醋酸水溶液2 min，放入5%磷鋁酸水溶液酶染2 min，放入0.2%冰醋酸水溶液洗2 min，甲基綠染色3 min，自來水沖洗，95%酒精分色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用Epidata、SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。TAG、TC、LDL-C、SDF-1、CXCR4、VEGF、IMT、MT、CA、CVA以（±s）表示，分析前進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)，若滿足正態(tài)性，采用LSD-t兩兩檢驗(yàn)，若不滿足正態(tài)性，數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后行LSD-t兩兩檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清TAG、TC、LDL-C水平的比較 見表1。與對(duì)照組比較，黃芪提取物各劑量組TAG、TC、LDL-C水平升高（P<0.05）；與模型組比較，黃芪提取物各劑量組TAG、TC、LDL-C降低，且劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯（P<0.05）；與阿托伐他汀組相比，黃芪提取物組低、中劑量組 TAG、TC、LDL-C 明顯升高 （P<0.05）。

表1 各組大鼠血清 TAG、TC、LDL-C 水平的比較（mmoL/L，±s）

表1 各組大鼠血清 TAG、TC、LDL-C 水平的比較（mmoL/L，±s）

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與阿托伐他汀組比較，◇P＜0.05，下同

組別 n L D L-C對(duì)照組 2 0 2.4 6±0.3 1模型組 2 0 3.7 5±0.3 7阿托伐他汀組 2 0 2.5 0±0.3 0 T A G T C 0.7 3±0.1 2 2.1 3±0 1 5 1.1 4±0.1 3 8.6 6±0.4 7 0.7 6±0.1 2 2.3 4±0.1 4黃芪低劑量組 2 0 3.3 5±0.3 1*△◇1.0 3±0.1 2*△◇ 6.1 4±0.3 4*△◇黃芪中劑量組 2 0 0.9 2±0.0 9*△◇ 4.2 3±0.2 3*△◇ 2.9 1±0.2 6*△◇黃芪高劑量組 2 0 0.7 7±0.1 0△ 2.3 5±0.1 6△ 2.5 1±0.3 0△

2.2 各組大鼠頸動(dòng)脈HE染色結(jié)果比較 見圖1。對(duì)照組頸脈管壁3層結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)連續(xù)完整，平滑肌細(xì)胞呈梭形，排列整齊；模型組頸脈管壁3層結(jié)構(gòu)混亂，內(nèi)膜增厚粗糙，內(nèi)皮細(xì)胞不連續(xù)，見大量巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞明顯增生，排列紊亂；黃芪提取物組低劑量組頸動(dòng)脈病理改變同模型組，無明顯改善；黃芪提取物組中、高劑量組可見較為清晰的3層結(jié)構(gòu)頸脈管壁，頸脈管內(nèi)膜增厚減輕，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)趨于完整，可見少量巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞排列整齊；阿托伐他汀組頸動(dòng)脈病理改變基本正常。

圖1 各組大鼠頸動(dòng)脈HE染色結(jié)果（200倍）

2.3 各組大鼠血清 SDF-1、CXCR4、VEGF水平的比較 見表2。與對(duì)照組比較，黃芪提取物各劑量組SDF-1、CXCR4、VEGF 水平升高（P<0.05）；與模型組比較，黃芪提取物各劑量組SDF-1、CXCR4、VEGF降低，且劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯（P<0.05）；與阿托伐他汀組比較，黃芪提取物組低、中劑量組SDF-1、CXCR4、VEGF明顯升高 （P<0.05）。

表2 各組大鼠血清 SDF-1、CXCR4、VEGF 水平的比較（ng/g，±s）

表2 各組大鼠血清 SDF-1、CXCR4、VEGF 水平的比較（ng/g，±s）

組別 n V E G F對(duì)照組 2 0 1 3 9.4 6±5.5 7模型組 2 0 1 7 9.7 5±7.3 7阿托伐他汀組 2 0 1 4 1.0 5±5.9 6 S D F-1 C X C R 4 2 7.8 6±6.9 8 4 7.1 3±1 5.9 5 4 5.7 7±6.4 6 1 8 7.6 6±9.4 7 2 9.4 5±6.9 8 5 3.4 4±1 0.0 4黃芪低劑量組 2 0 1 6 9.3 5±8.8 8*△◇3 9.5 8±8.9 7*△◇ 1 3 4.1 4±1 2.7 4*△◇黃芪中劑量組 2 0 3 3.6 3±1 2.7 3*△◇ 6 3.2 3±1 0.7 3*△◇ 1 4 6.3 1±1 2.7 6*△◇黃芪高劑量組 2 0 3 0.1 5±1 0.6 9△ 5 4.4 5±8.7 6△ 1 4 2.8 1±9.6 0△

2.4 各組大鼠頸動(dòng)脈IMT、MT水平的比較 見圖2，表3。與對(duì)照組比較，黃芪提取物各劑量組頸動(dòng)脈IMT、MT 水平升高（P<0.05）；與模型組比較，黃芪提取物各劑量組頸動(dòng)脈IMT、MT水平降低，且劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯（P<0.05）；與阿托伐他汀組比較，黃芪提取物組低、中劑量組頸動(dòng)脈IMT、MT水平明顯升高（P<0.05）。

表3 各組大鼠頸動(dòng)脈IMT、MT水平的比較（μm，±s）

組 別 n對(duì)照組 2 0模型組 2 0阿托伐他汀組 2 0 I M T M T 1 2.7 3±2.6 5 1 5 2.1 3±1 5.7 6 5 1.6 5±1 2.8 7 2 1 3.7 6±3 4.7 6 1 6.7 6±5.1 2 1 6 7.8 7±1 4.6 7黃芪低劑量組 2 0 4 1.6 3±7.6 5*△◇ 2 0 9.7 6±1 3.5 2*△◇黃芪中劑量組 2 0 2 6.7 6±8.6 5*△◇ 1 8 9.7 6±1 6.8 7*△◇黃芪高劑量組 2 0 1 7.7 6±6.4 3△ 1 7 0.7 6±1 5.8 5△

2.5 各組大鼠頸動(dòng)脈CA、CVA水平的比較 見表4。與對(duì)照組比較，黃芪提取物各劑量組頸動(dòng)脈CA、CVA水平升高（P<0.05）；與模型組比較，黃芪提取物各劑量組頸動(dòng)脈CA、CVA水平降低，且劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯（P<0.05）；與阿托伐他汀組比較，黃芪提取物組低、中劑量組頸動(dòng)脈CA、CVA水平明顯升高 （P<0.05）。

2.6 各組大鼠頸動(dòng)脈MASSON染色結(jié)果 見圖3。MASSON染色下膠原纖維呈藍(lán)色，平滑肌細(xì)胞呈紅色，彈力纖維呈棕色。圖3可見，對(duì)照組頸動(dòng)脈內(nèi)膜膠原含量少，平整光滑，中膜可見少量膠原纖維（混雜于彈力纖維和肌纖維之間），排列規(guī)則；模型組頸動(dòng)脈內(nèi)膜明顯增厚，布滿大量藍(lán)色纖維，少見紅色平滑肌細(xì)胞，排列極其扭曲、斷裂；黃芪提取物組低劑量組見不規(guī)則空白區(qū)域，其余視野布滿大量藍(lán)色纖維，無明顯改善；黃芪提取物組中、高劑量組頸動(dòng)脈內(nèi)膜較模型組明顯變薄，藍(lán)色纖維減少，見彈力纖維排列整齊，局部欠規(guī)則；阿托伐他汀組MASSON染色結(jié)果同對(duì)照組。

圖3 各組大鼠頸動(dòng)脈（Masson染色，200倍）

3 討 論

SDF-1/CXCR4能強(qiáng)烈促進(jìn)血管內(nèi)皮的增殖分化，是作用強(qiáng)烈的趨化因子，在炎癥反應(yīng)中與中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的趨化密切相關(guān)［7］。研究表明，在動(dòng)脈粥樣硬化的形成過程中，SDF-1/CXCR4的表達(dá)與白細(xì)胞介素-1（IL-1）、血小板衍生因子（PDGF）、腫瘤壞死因子 （TNF）等炎癥因子的分泌以及細(xì)胞外基質(zhì)（EMC）的沉淀均正相關(guān)關(guān)系明顯［8-9］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明［10］，在動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型中，大鼠動(dòng)脈SDF-1、CXCR4蛋白表達(dá)水平異常增高。本研究中，模型組血清SDF-1、CXCR4水平明顯高于對(duì)照組，這與上述結(jié)論符合。SDF-1/CXCR4是維持內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能完整性必不可少的調(diào)控因子，但高水平的SDF-1/CXCR4能破壞內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)，暴露膠原組織，刺激血小板附著和聚集，從而激活凝血反應(yīng)鏈，導(dǎo)致纖維蛋白及免疫球蛋白也應(yīng)激增高，同時(shí)高水平的SDF-1/CXCR4可通過增加細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶活性，促進(jìn)細(xì)胞增殖，進(jìn)而使血管內(nèi)壁增粗狹窄，并抑制細(xì)胞金屬基質(zhì)酶（MMP）的分泌，導(dǎo)致MMP對(duì)EMC的降解作用減弱，進(jìn)而使得細(xì)胞與EMC的聚集加強(qiáng)，加之高水平的SDF-1/CXCR4可介導(dǎo)細(xì)胞的定向轉(zhuǎn)移和趨化性，激活淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞上相應(yīng)的趨化因子受體，形成高凝狀態(tài)和纖溶亢進(jìn)，終致血液黏滯性及凝固性增加而處于高凝狀態(tài)或血栓前狀態(tài)，進(jìn)一步誘發(fā)頸動(dòng)脈粥樣硬化的產(chǎn)生［11-12］。細(xì)胞試驗(yàn)表明，VEGF能直接促進(jìn)Ⅰ型膠原和 Ⅳ型膠原、纖溶酶原激活物抑制因子、基質(zhì)蛋白沉淀于系膜細(xì)胞外［13］。在高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化中，血管緊張素的增多也可誘導(dǎo)VEGF過度表達(dá)。近年來，多項(xiàng)研究表明［14］，動(dòng)脈粥樣硬化硬塊斑與SDF-1、CXCR4、VEGF的異常高表達(dá)密切相關(guān)。大鼠動(dòng)物試驗(yàn)已證實(shí)［15］，通過中西藥均能明顯抑制SDF-1、CXCR4、VEGF水平，緩解動(dòng)脈粥樣硬化癥狀。

黃芪提取物具有降低血黏度、改善血管舒縮功能、抗凝、抑制血栓形成、維持微循環(huán)穩(wěn)定、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功效。本研究HE染色結(jié)果顯示，黃芪提取物組中、高劑量組可見較為清晰的3層結(jié)構(gòu)頸脈管壁，頸脈管內(nèi)膜增厚減輕，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)趨于完整，可見少量巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞排列整齊；阿托伐他汀組頸動(dòng)脈病理改變基本正常；MASSON染色結(jié)果及IMT、MT、CA、CVA水平的測(cè)定與HE染色結(jié)果符合，說明黃芪提取物能明顯降低大鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊程度，其高劑量效果尤為明顯。結(jié)合對(duì)TAG、TC、LDLC、SDF-1、CXCR4、VEGF 的結(jié)果分析，與對(duì)照組比較，黃芪提取物各劑量組頸動(dòng)脈TAG、TC、LDL-C、SDF-1、CXCR4、VEGF水平升高；與模型組比較，黃芪提取物各 劑 量 組 頸動(dòng)脈 TAG、TC、LDL-C、SDF-1、CXCR4、VEGF水平降低，且劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯；與阿托伐他汀組相比，黃芪提取物組低、中劑量組頸動(dòng)脈TAG、TC、LDL-C、SDF-1、CXCR4、VEGF 水平明顯升高 ，高劑量組頸動(dòng)脈 TAG、TC、LDL-C、SDF-1、CXCR4、VEGF 水平略微升高。結(jié)果說明黃芪提取物能降低TAG、TC、LDL-C、SDF-1、CXCR4、VEGF 水平，進(jìn)而降低大鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊程度，且具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

綜上所述，黃芪提取物能降低TAG、TC、LDL-C、SDF-1、CXCR4、VEGF水平，進(jìn)而降低大鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊程度，且具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。