養(yǎng)心顆粒對易損斑塊Rho/Rho激酶信號通路血清IL-1、MCP-1和AngⅡ表達(dá)的影響*

劉影哲 張 爽 潘祥賓

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001）

動脈粥樣硬化（AS）是一種血管的炎性疾病，同時也是冠心病及高血壓等心腦血管疾病的危險因素，2017中國心血管病報告顯示，中國心血管病患者呈逐年遞增趨勢，患病人數(shù)近3億，病死率仍居首位［1］，而AS的病因和發(fā)病情況目前仍未確定，AS防治方面也尚未完善［2］。最新研究顯示，Rho/Rho激酶通過多種途徑介導(dǎo)了心血管疾病的發(fā)生［3］。炎癥反應(yīng)在AS的發(fā)生發(fā)展中占據(jù)著重要作用［4］。因此，通過調(diào)控Rho/Rho激酶信號通路抑制炎性因子傳導(dǎo)，從而減慢AS斑塊形成速度，這可能是防治AS新的有效靶點(diǎn)。前期研究結(jié)果表明，養(yǎng)心顆粒能防心纖維化，抑制心室重構(gòu)，緩解心衰［5］。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察養(yǎng)心顆粒對易損斑塊Rho/Rho激酶信號通路及炎癥因子血清白介素-1（IL-1）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）表達(dá)的影響，探討其抗AS的作用進(jìn)而實(shí)現(xiàn)斑塊穩(wěn)定的作用機(jī)制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 32只雄性家兔，體質(zhì)量（2.4±0.2）kg，均來自于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，動物合格證號 SYXK：（黑）2013-012。在通風(fēng)、溫度 20～23 ℃、溫度適宜的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境里分籠喂養(yǎng)。

1.2 試藥與儀器 1）藥物：養(yǎng)心顆粒（組成：茯苓、炙黃芪、茯神、當(dāng)歸、法半夏、川芎各15 g，酸棗仁、五味子、遠(yuǎn)志、肉桂、柏子仁、人參各10 g，炙甘草12 g）。由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室制備成粉末，每克粉末中含7 g生藥，將中藥粉末加蒸餾水定期配制成混懸液；法舒地爾 （天津紅日藥業(yè)股份有限公司，批號 1709081）。 2）試劑：兔 IL-1、MCP-1、AngⅡ試劑盒（美國R＆D生物技術(shù)公司）；中國斑點(diǎn)蝰蛇毒（Chinese Russell′s viper Venom，CRVV，廣州蛇毒研究所）；組胺及p53腺病毒載體。3）儀器：2.5 mm×15 mm PTCA球囊（日本TERUMO公司）；手推式壓力器（愛爾蘭MERITMEDICAL公司）。

1.3 模型制備 采用2.5 mm×15 mm球囊經(jīng)頸總動脈連接手推式壓力器介入損傷家兔頸總動脈，并予高脂飼料喂養(yǎng)8周來制備粥樣硬化斑塊模型，8周末經(jīng)體表超聲多普勒檢查證實(shí)頸總動脈斑塊的形成，利用p53基因腺病毒注射液局部轉(zhuǎn)染斑塊處制備易損斑塊模型，各組模型按0.15 mg/kg腹膜下注射中國斑點(diǎn)蝰蛇毒，0.02 mg/kg耳緣靜脈注射組胺，處死前采血。模型復(fù)制成功標(biāo)準(zhǔn)：造模組可見頸總動脈內(nèi)膜增厚，動脈粥樣硬化斑塊形成，管腔明顯狹窄。

1.4 分組及給藥 隨機(jī)將家兔分為模型對照組、養(yǎng)心顆粒組和法舒地爾組，每組8只予高脂飼料喂養(yǎng)8周；空白對照組則選用同系家兔8只，予普通喂養(yǎng)。按人兔給藥劑量體表面積折算公式計(jì)算給藥量，養(yǎng)心顆粒組按0.643 g/kg給藥；法舒地爾組予法舒地爾（天津紅日藥業(yè)股份有限公司，批號：1709081，規(guī)格 2 mL∶30 mg）5 mg/kg給藥，每日1次，連續(xù)灌胃2周。其他兩組均灌胃等量蒸餾水。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 1）家兔耳緣靜脈取血，以4000 r/min離心5 min，取上層血清，-20℃冷凍保存。按照IL-1試劑盒、MCP-1試劑盒和AngⅡ試劑盒方法測定相應(yīng)指標(biāo)含量。2）頸總動脈根部取一段長約0.5 cm，予甲醛固定，計(jì)算主動脈斑塊面積（PA）和管腔面積（LA），取PA/LA均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，相關(guān)性分析采用Pearson直線相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組家兔血清IL-1、MCP-1、AngⅡ表達(dá)水平比較見表1。 與空白組比較，模型組 IL-1、MCP-1、AngⅡ水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，養(yǎng)心顆粒和法舒地爾組IL-1、MCP-1、AngⅡ水平明顯降低（P＜0.05）；與法舒地爾組比較，養(yǎng)心顆粒組IL-1、MCP-1、AngⅡ水平變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表1 各組家兔 IL-1、MCP-1、AngⅡ表達(dá)水平比較（ng/L，±s）

表1 各組家兔 IL-1、MCP-1、AngⅡ表達(dá)水平比較（ng/L，±s）

與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。 下同

組 別 n A n gⅡI L-1 M C P-1空白組 8 2 2 0.0 1±1 7.8 6模型組 8 2 4 3.8 6±2 4.1 2*養(yǎng)心顆粒組 8 1 9 7.3 6±2 0.4 5△5 2.3 1±1 2.0 6 4 7 1.7 2±5 2.6 1 6 2.8 7±7.3 7* 5 2 1.2 7±3 2.3 7*3 8.7 9±6.4 7△ 4 2 1.3 3±5 1.4 5△法舒地爾組 8 1 8 3.1 5±9.1 7△4 0.4 1±6.9 9△ 3 9 0.7 5±4 9.9 6△

2.2 各組家兔頸總動脈管腔狹窄程度的比較 見圖1，表2。與空白對照組比較，模型組家兔頸總動脈PA/LA比值升高（P＜0.05）；與模型組比較，養(yǎng)心顆粒組和法舒地爾組家兔頸總動脈PA/LA比值降低 （P＜0.05）；養(yǎng)心顆粒組和法舒地爾組比較，PA/LA比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

圖1 各組家兔頸總動脈根部PA/LA比值比較

表2 各組家兔頸總動脈根部PA/LA比值比較（%）

2.3 各組家兔血清IL-1、MCP-1、AngⅡ表達(dá)水平相關(guān)系數(shù)比較 見表3。IL-1、MCP-1、AngⅡ表達(dá)水平兩兩呈正相關(guān)（P＜0.05），其中MCP-1與AngⅡ的相關(guān)性最強(qiáng)。

3 討 論

動脈粥樣硬化易損斑塊是防治不良心血管事件的重點(diǎn)，異常的切應(yīng)力可使血管通透性升高促使斑塊生長和炎癥反應(yīng)的發(fā)生［6］，加速斑塊破裂和新生血管的生成［7］，易損斑塊一旦發(fā)生破裂形成動脈血栓，會誘發(fā)不穩(wěn)定型心絞痛、急性心肌梗死等嚴(yán)重并發(fā)癥出現(xiàn)。中醫(yī)根據(jù)AS的臨床表現(xiàn)將其概括為“中風(fēng)”“胸痹”等疾病范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，本虛標(biāo)實(shí)為AS的病機(jī)，其“標(biāo)實(shí)”表現(xiàn)為氣滯、寒凝、痰濁、血瘀，“本虛”為腎虛、氣虛，而筆者認(rèn)為冠心病的病機(jī)概括為心氣不足，其心神失養(yǎng)貫通整個疾病的過程。故臨床以益氣養(yǎng)血、養(yǎng)心安神為治療大法的養(yǎng)心顆粒醫(yī)治本病。養(yǎng)心顆粒是由古方養(yǎng)心湯的藥物組成而研制成顆粒粉末，由當(dāng)歸、炙黃芪、茯苓、五味子等十余味藥組成。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黃芪對心血管系統(tǒng)有改善心肌肥大、緩解心肌缺血、抗病毒和防心纖維化、擴(kuò)張主動脈血管的作用［8］。五味子能營養(yǎng)心肌、改善睡眠、抗心律失常［9］。

表3 各組家兔血清IL-1、MCP-1、AngⅡ表達(dá)水平相關(guān)系數(shù)比較（ng/L，±s）

表3 各組家兔血清IL-1、MCP-1、AngⅡ表達(dá)水平相關(guān)系數(shù)比較（ng/L，±s）

指標(biāo) A n gⅡI L-1 M C P-1 I L-1（n g/L） 0.4 9 3 M C P-1（n g/L） 0.7 4 7 0.5 4 9 0.5 4 9 ——A n gⅡ（n g/L） —0.4 9 3 0.7 4 7

研究發(fā)現(xiàn)，在AS斑塊中可發(fā)現(xiàn)有激活狀態(tài)的Rho激酶，Rho激酶被激活后參與調(diào)控相關(guān)炎癥因子，促進(jìn)AS斑塊形成，表明Rho激酶信號通路的激活與AS疾病的演變過程緊密相連［10］。本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)模型組頸總動脈組織中有處于激活狀態(tài)的Rho表達(dá)。Rho是一種能產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)的活性G蛋白，其本質(zhì)為具有 GTP 酶活性的鳥苷三磷酸（GTP）結(jié)合蛋白［11］。 Rho在鳥苷二磷酸結(jié)合失活形式與GTP結(jié)合活化形式間進(jìn)行轉(zhuǎn)換，調(diào)控下游效應(yīng)物質(zhì)的激活與失活［12］，參與多種細(xì)胞功能，包括收縮、遷移、黏附、增殖、凋亡等［13］。在AS形成過程中，Rho激酶能上調(diào)促炎癥反應(yīng)和促血栓形成因子， 如 IL-1、IL-6、MCP-1、TNF-α、AngⅡ等細(xì)胞因子，可通過多種途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，共同參與AS等心腦血管疾病的調(diào)節(jié)過程。本研究結(jié)果亦表明，IL-1、MCP-1與AngⅡ表達(dá)水平具有良好的相關(guān)性。RhoA/ROCK激活后可調(diào)節(jié)胞質(zhì)內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)移，調(diào)節(jié)下游IL-1β等炎性反應(yīng)因子的生成［14］。實(shí)驗(yàn)研究表明［15］，在高脂喂養(yǎng)下的ApoE基因小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)炎癥因子IL-1β和α干擾素表達(dá)明顯增高，表明該種模型小鼠更容易形成易損斑塊，動脈粥樣硬化模型小鼠血清IL-1β表達(dá)水平越高，主動脈內(nèi)膜增厚、脂質(zhì)斑塊彌漫越顯著。Rho激酶可促進(jìn)MCP-1的表達(dá)介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的激活，而趨化因子MCP-1又能促進(jìn)巨噬細(xì)胞聚集、滲透，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞吞噬oxGLDL導(dǎo)致脂質(zhì)沉積，分泌促炎細(xì)胞因子，致使基質(zhì)金屬蛋白酶釋放，同時對外周血中的單核細(xì)胞有特異性的趨化作用，使其遷移至內(nèi)皮下活化成巨噬細(xì)胞，形成泡沫細(xì)胞參與炎性反應(yīng)和 AS 的斑塊形成［16］。 研究發(fā)現(xiàn)［17］，血漿中 MCP-1濃度與PI呈正相關(guān)性，兩者在AS基礎(chǔ)上可發(fā)生炎癥、凝血甚至血栓，它引起的炎癥反應(yīng)可使 AS斑塊破裂，而且MCP-1含量越高，AS不穩(wěn)定性增加，斑塊破裂的風(fēng)險更有可能發(fā)生。AngⅡ生物活性較強(qiáng)，可分泌多種生長因子和炎性細(xì)胞，引起氧化應(yīng)激造成內(nèi)皮損傷或炎癥狀態(tài)。De Silva等研究發(fā)現(xiàn)，異常的ROCKⅡ信號激活后可造成AngⅡ介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷而產(chǎn)生炎性反應(yīng)，導(dǎo)致心腦血管疾病的發(fā)生［18］。徐敏等發(fā)現(xiàn)將高脂飲食的ApoE基因缺陷大鼠通過皮下植入方式填充AngⅡ，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組術(shù)后更易形成易損斑塊［19］。本研究在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)模型組炎性細(xì)胞因子IL-1、MCP-1及AngⅡ表達(dá)水平明顯升高，提示炎癥反應(yīng)存在。

本研究結(jié)果表明，炎性細(xì)胞因子之間存在緊密的聯(lián)系，共同參與了AS的演變過程，而服用養(yǎng)心顆粒治療后，發(fā)現(xiàn)Rho/Rho激酶信號通路被明顯阻斷，炎性細(xì)胞因子IL-1、MCP-1及AngⅡ表達(dá)水平明顯降低，頸總動脈內(nèi)膜的斑塊面積明顯減小。筆者認(rèn)為養(yǎng)心顆?？赡芡ㄟ^調(diào)控Rho/Rho激酶信號通路水平，抑制AS病理變化過程中炎性因子的表達(dá)，降低炎癥反應(yīng)，發(fā)揮抗AS的作用進(jìn)而實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定易損斑塊的作用機(jī)制。但對于養(yǎng)心顆粒是否通過干預(yù)其他相關(guān)信號通路來發(fā)揮抗AS的作用，有待進(jìn)一步深入研究。