電針對功能性消化不良大鼠MEK-ERK1/2信號通路的影響*

康朝霞 徐派的△ 唐 雷 王計(jì)雨 韓永麗 張紅星

（1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430061；2.湖北省武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，湖北 武漢430022）

功能性消化不良（FD）為多見的功能性胃腸疾病之一，根據(jù)羅馬Ⅳ診斷標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)D被認(rèn)為是具有早飽、餐后飽脹、上腹痛或上腹燒灼感等不適，但不存在可以解釋以上不適的器質(zhì)性、代謝性、全身性病變［1］。根據(jù)全球流行病學(xué)的數(shù)據(jù)，F(xiàn)D以20.8%的高患病率，占用了大量醫(yī)療資源［2］。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是一類細(xì)胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因?yàn)樗{(diào)節(jié)多種多樣的細(xì)胞反應(yīng)，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，影響分化、存活和凋亡［3］。并且研究發(fā)現(xiàn)AMPK在調(diào)節(jié)應(yīng)激炎癥反應(yīng)發(fā)揮中重要作用，參與了胃黏膜上皮增殖、分化與凋亡等過程的調(diào)控［4］。與細(xì)胞信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被認(rèn)為是經(jīng)典的絲裂原活化蛋白激酶（MEK）信號途徑，被各種刺激因素激活后，可調(diào)節(jié)胃腸黏膜上皮細(xì)胞的增殖與修復(fù)，與結(jié)腸炎、胃炎等胃腸疾病密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用夾尾刺激法構(gòu)建FD大鼠模型，采用臨床常用的電針療法進(jìn)行干預(yù)，旨在觀察電針對FD模型大鼠MEK、ERK1/2蛋白及其磷酸化蛋白表達(dá)的影響，以探討其可能的作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級SD 8周齡雄性大鼠40只購于湖北實(shí)驗(yàn)動物研究中心，體質(zhì)量（200±20）g，飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)SPF動物房，動物房溫度控制在（22±2） ℃，濕度（60±10）%，明/暗每 12小時(shí)交替。每 5只單籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 試藥與儀器 環(huán)球牌0.3 mm×25 mm一次性無菌針灸針；韓式穴位神經(jīng)刺激儀（南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司，200A型）；兔多抗 MEK1/2抗體 （45 kD）（Affinity#AF6385；兔多抗 ERK1/2（42/44 kD）（睿瀛生物公司#RLT1625）；兔多抗磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶 1/2（p-MEK1/2）（Ser221，44 kD）（Affinity#AF3385）；兔多抗磷酸化細(xì)胞信號調(diào)節(jié)激酶1/2（p-ERK1/2）（Thr202/Tyr204，44/42 kD）（Affinity#AF1015）。

1.3 分組與造模 將40只雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組（10只）及造模組（30只）。對30只造模組大鼠進(jìn)行造模，將其中造模成功的20只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組（10只）及電針組（10只）。造模方法依據(jù)參考文獻(xiàn)采用夾尾刺激+不規(guī)則飲食的復(fù)合造模方法制備FD模型［5］。用紗布纏繞的血管鉗夾大鼠尾巴末尾1/3段（盡量不使大鼠尾巴破皮），令大鼠尖叫、暴怒，引起同籠大鼠彼此廝打，每次持續(xù)30 min，每日2次（分別在上午9點(diǎn)，下午4點(diǎn)），連續(xù)造模14 d。同時(shí)進(jìn)食與禁食每24小時(shí)進(jìn)行交替（即隔日給予每籠220 g飼料），正常給予每日每籠400 mL水。造模大鼠呈現(xiàn)毛發(fā)粗糙、枯黃，進(jìn)食、飲水下降，活動減弱，扎堆乃至蜷縮，情志抑郁不安，表明造模成功。電針干預(yù)方法：電針組大鼠造模成功后，進(jìn)行電針干預(yù)。用自制大鼠捆綁衣將電針組大鼠束縛并懸掛于懸掛裝置上。用0.3 mm×25 mm一次性不銹鋼針刺大鼠雙側(cè)“足三里”穴 0.3～0.5 寸（定位參照《大鼠穴位圖譜的研制》［6］），得氣后接韓式電針儀（疏密波，2 Hz/100 Hz，2 mA）每次30 min，每日1次，共10 d?？瞻捉M及模型組大鼠在治療階段予以穿鼠衣捆綁并懸掛在懸掛裝置上30 min，但不接受電針干預(yù)。

1.4 標(biāo)本采集與檢測 胃竇取材：電針干預(yù)10 d后，將3組大鼠禁食24 h（期間不禁水）。按照大鼠體質(zhì)量（100 g為單位）予以7%水合氯醛0.5 mL進(jìn)行腹腔注射麻醉，麻醉后將大鼠固定于自制鼠板上，剖腹，結(jié)扎胃賁門和幽門后剪下大鼠胃，沿胃大彎剪開胃體，洗凈胃內(nèi)容物后濾紙擦干，剪下胃竇放于凍存管中后立即置于液氮中快速凍存，存于-80℃冰箱中待測。用免疫蛋白印跡（Western blotting）法檢測胃竇組織中MEK、ERK1/2及p-MEK、p-ERK1/2蛋白表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料（±s）表示。首先，進(jìn)行正態(tài)性、方差齊性分析，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布及方差齊性者，選用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行多組間比較，進(jìn)一步的組間兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠胃組織MEK、ERK1/2蛋白水平比較見表1，圖1。與空白組比較，模型組大鼠胃組織MEK、ERK1/2蛋白表達(dá)增加（P<0.05）；與模型組比較，電針組胃組織MEK、ERK1/2表達(dá)降低（P<0.05）。結(jié)果說明電針足三里可以降低FD大鼠MEK、ERK1/2蛋白水平。

表1 各組大鼠胃竇MEK/GAPDH、ERK1/2/GAPDH灰度比值比較（±s）

表1 各組大鼠胃竇MEK/GAPDH、ERK1/2/GAPDH灰度比值比較（±s）

與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。 下同

組別 n M E K/G A P D H E R K 1/2/G A P D H空白組 1 0 0.2 0 2±0.1 1 3 0.2 6 2±0.1 9 5模型組 1 0 0.5 6 4±0.0 9 9* 0.7 9 6±0.1 0 7*電針組 1 0 0.2 5 8±0.3 8△ 0.4 7 2±0.1 2 1△

圖1 各組大鼠胃竇MEK、ERK蛋白免疫印跡圖

2.2 各組大鼠胃組織p-MEK、p-ERK1/2蛋白水平比較 見表2，圖2。與空白組比較，模型組大鼠胃組織p-MEK、pERK1/2 蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05）；與模型組比較，電針組胃組織p-MEK、p-ERK1/2表達(dá)水平降低（P<0.05）。結(jié)果說明電針足三里可以降低FD大鼠p-MEK、p-ERK1/2蛋白水平的表達(dá)。

表2 各組大鼠胃竇p-MEK/GAPDH、p-ERK1/2/GAPDH灰度比值比較（±s）

表2 各組大鼠胃竇p-MEK/GAPDH、p-ERK1/2/GAPDH灰度比值比較（±s）

組別 n p-M E K/G A P D H p-E R K 1/2/G A P D H空白組 1 0 0.1 3 0±0.0 4 3 0.2 1 5±0.0 9 8模型組 1 0 0.5 1 5±0.0 7 9* 0.8 2 2±0.0 8 1*電針組 1 0 0.2 4 5±0.3 8 9△ 0.4 5 9±0.1 0 9△

圖2 各組大鼠胃組織p-MEK、pERK1/2蛋白免疫印記圖

3 討 論

功能性胃腸道疾病，如FD、腸易激綜合征（IBS），具有相當(dāng)大的社會經(jīng)濟(jì)負(fù)面影響［7］。雖然FD不會危及生命，但它會顯著影響患者的生活質(zhì)量（QOL）［8］并導(dǎo)致高昂的醫(yī)療費(fèi)用［9］。如今，眾多藥物如質(zhì)子泵抑制劑（PPI）、三環(huán)類抗抑郁藥，抗傷害性藥物和促運(yùn)動劑已被用于治療FD［10］，但由于其臨床表現(xiàn)多樣性、差異大的特點(diǎn)，療效不甚滿意。因此，越來越多的患者開始尋求一種經(jīng)濟(jì)、療效好的替代療法。近年來，針刺、電針等經(jīng)大量的臨床、實(shí)驗(yàn)研究證明，治療FD療效顯著［11］，且具有經(jīng)濟(jì)、無明顯的毒副作用的優(yōu)勢。本課題組在以往研究中也證實(shí)了電針足三里穴對FD具有良好的治療作用。

FD在中醫(yī)學(xué)隸屬于“胃脘痛”“痞滿”等范疇，其病因病機(jī)為飲食不節(jié)、情志不遂等，病變在胃，與肝脾密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)從本病的病因出發(fā)，采用適度夾尾刺激配合隔日進(jìn)食的造模方法，模擬人體肝郁氣滯、脾胃失和的發(fā)病機(jī)理，使造模成功的概率大大提升。在臨床運(yùn)用針刺治療FD療效甚好，并且其治療作用在臨床及動物實(shí)驗(yàn)中均得到了證實(shí)。而足三里為足陽明胃經(jīng)合穴，又是胃的下合穴，“合治內(nèi)腑”，善調(diào)脾胃，調(diào)腸腑，滋后天生化之源。《四總穴歌》“肚腹三里留”充分說明了足三里穴善治脾胃的特點(diǎn)。目前，“足三里”已經(jīng)成為電針治療FD的公認(rèn)效穴。電針的運(yùn)用，不但傳承了傳統(tǒng)針灸的特色，并且還融會了電刺激的生理效應(yīng)，卓有成效。

MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑通過參與細(xì)胞生長、發(fā)育、分化和死亡過程，以及細(xì)胞間各種生化反應(yīng)的識別、傳遞和擴(kuò)增，在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)應(yīng)激炎癥反應(yīng)中起著重要作用［12-13］，參與了胃黏膜上皮增殖、分化與凋亡的調(diào)控。MAPK經(jīng)典信號途徑——與ERK1/2相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可被各種信號刺激（如炎癥、神經(jīng)損傷、神經(jīng)遞質(zhì)）而激活，而活化的ERK1/2，即p-ERK1/2可通過激活或抑制其他蛋白激酶底物，從而調(diào)節(jié)蛋白合成，影響細(xì)胞代謝，從而參與細(xì)胞存活、增殖、分化與遷移等過程［14-15］。已有研究表明，ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與胃腸黏膜細(xì)胞的增殖與修復(fù)過程［16-18］，對于胃腸黏膜的防御與修復(fù)具有重要影響，與胃炎、胃潰瘍等疾病密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用免疫印跡法檢測FD大鼠胃竇組織中MEK、ERK1/2蛋白表達(dá)及磷酸化程度，結(jié)果表明，與空白組相比模型組大鼠MEK、ERK1/2蛋白表達(dá)及其磷酸化程度均升高，說明在FD模型大鼠胃竇組織中，呈現(xiàn)MEK、ERK1/2及其磷酸化蛋白p-MEK、p-ERK1/2蛋白表達(dá)的異常升高，而電針足三里穴抑制了FD模型大鼠胃竇MEK、ERK1/2蛋白表達(dá)及其磷酸化程度。因此MEK-ERK1/2信號通路參與電針干預(yù)FD的過程，電針可能通過抑制MEK/ERK1/2信號的激活改善FD相關(guān)癥狀，為電針治療FD的機(jī)制研究提供新的研究線索，而有關(guān)MEK-ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在電針治療FD大鼠過程中的具體作用機(jī)制，還有待我們進(jìn)一步研究。