超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定母乳中拉貝洛爾的含量

陳宇　鄭新　陳立波

[摘要] 目的 建立快速測(cè)定母乳中拉貝洛爾含量的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）。 方法 母乳樣品經(jīng)甲醇-乙腈混合溶液沉淀蛋白，稀釋后離心取上清液進(jìn)樣。色譜柱為Thermo Scientific Syncronis C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），初始流動(dòng)相為0.2%甲酸溶液-乙腈（80∶20，V/V），流速為0.2 mL/min，梯度洗脫，AJS ESI正離子模式電離，多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式（MRM）檢測(cè)，外標(biāo)法定量。 結(jié)果 母乳中拉貝洛爾在1.042～104.2 ng/mL范圍內(nèi)線性良好（r = 0.9988），定量下限為1.042 ng/mL，準(zhǔn)確度為92.0%～104.8%，批內(nèi)、批間RSD均小于15%，提取回收率為82.2%～92.4%。 結(jié)論 本方法前處理簡單、準(zhǔn)確，專屬性強(qiáng)、靈敏度高，可用于拉貝洛爾的乳藥濃度監(jiān)測(cè)。

[關(guān)鍵詞] 拉貝洛爾；超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法；乳藥濃度；藥物監(jiān)測(cè)

[中圖分類號(hào)] RTS218；O657.63 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）11（c）-0085-04

[Abstract] Objective To establish an ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） method for rapid determination of labetalol in breast milk. Methods The breast milk sample was precipitated by a methanol-acetonitrile mixed solution， and after centrifugation， the supernatant was centrifuged for injection. The column was Thermo Scientific Syncronis C18 （100 mm × 2.1 mm， 1.7 μm）， the initial mobile phase was 0.2% formic acid solution-acetonitrile （80∶20， V/V）， the flow rate was 0.2 mL/min， utilizing a gradient elution program. The MS/MS detection was performed under AJS ESI+ in MRM mode， quantitatived by external standard method. Results The linear range of Labetalol was 1.042-104.2 ng/mL （r = 0.9988），with the low limit of quantitation of 1.042 ng/mL. Accuracy was 92.0%-104.8%， intra-batch and inter-batch relative standard deviations were both below 15%. The absolute recovery in breast milk was 82.2%-92.4%. Conclusion The method is simple， accurate， specific， and with high sensitivity， which can be used for concentration in breast milk monitoring of labetalol.

[Key words] labetalol； Ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry； Concentration in breast milk； Drug monitoring

拉貝洛爾為α、β腎上腺素能受體阻滯劑，劑型多樣，是孕婦妊娠高血壓常用的降壓藥物[1-7]。臨床應(yīng)用其解除妊娠因素后不能立即停藥或存在血壓未下降至正常的情況，產(chǎn)婦往往仍需要降壓治療數(shù)天甚至更長，且需要權(quán)衡服藥和母乳喂養(yǎng)之間的利弊。雖然文獻(xiàn)報(bào)道拉貝洛爾對(duì)母親及乳兒影響較小[8-10]，但是鹽酸拉貝洛爾片說明書[11]中哺乳期用藥信息寫到“乳汁中的濃度為母體血液的22%～45%，乳母慎用”。另有報(bào)道稱新生兒誤服拉貝洛爾可致心力衰竭[12]。為在保證產(chǎn)婦得到有效治療的前提下，最大限度降低拉貝洛爾對(duì)新生兒的不利影響，有必要對(duì)拉貝洛爾乳藥濃度進(jìn)行監(jiān)測(cè)。目前，國內(nèi)外未見對(duì)母乳中拉貝洛爾含量測(cè)定的報(bào)道。鹽酸拉貝洛爾[13]和鹽酸拉貝洛爾注射液[14]采用高效液相色譜法HPLC測(cè)定含量，其紫外檢測(cè)器在生物樣本中的檢測(cè)靈敏度不符合定量要求。報(bào)道的血漿中拉貝洛爾的含量測(cè)定方法主要有LC-MS/MS[15]和HPLC-FLU[16]，其需液-液萃取后濃縮富集，操作繁瑣耗時(shí)。本研究擬建立用于快速測(cè)定母乳中拉貝洛爾的含量超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS），簡化操作，為臨床拉貝洛爾乳藥濃度的監(jiān)測(cè)及母嬰安全用藥提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1290-6460超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫科技有限公司）；XS-205DU電子分析天平（梅特勒-托利多）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；ST16R高速冷凍離心機(jī)（美國賽默飛世爾科技有限公司）；M37610-33CN渦旋混合器（美國賽默飛世爾科技有限公司）；Synergy超純水機(jī)（默克密理博）。

1.2 試藥

鹽酸拉貝洛爾對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，生產(chǎn)批號(hào)：100484-201001，純度≥99.8%）；甲醇（色譜純，默克股份兩合公司）；乙腈（色譜純，默克股份兩合公司）；甲酸（優(yōu)級(jí)純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；超純水（電阻率18.2 MΩ·cm，密理博超純水機(jī)制備）。

60份口服鹽酸拉貝洛爾片的妊娠高血壓產(chǎn)婦乳汁樣本由玉林市婦幼保健院采集，空白乳汁樣本由健康產(chǎn)婦提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

色譜條件 色譜柱：Thermo Scientific Syncronis C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：A為0.2%甲酸溶液，B為乙腈，梯度程序程序：0～3 min，20%～60%B；3～5 min，60%～90%B；5～8 min，90%B；8～8.1 min，90%～20%B；8.1～12 min，20%B。流速：0.2 mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：5 μL。

質(zhì)譜條件 AJS ESI源正離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）掃描；干燥氣溫度300℃，干燥氣流量5 L/min，霧化器壓力45 psi，鞘氣溫度250℃，鞘氣流量11 L/min，毛細(xì)管電壓4000 V，噴嘴電壓500 V；拉貝洛爾定量離子m/z 329 →310.8（裂解電壓100 V，碰撞能量5 eV），定性離子為m/z 329 →161.8（裂解電壓100 V，碰撞能量25 eV）。

2.2 甲醇-乙腈混合液

分別量取甲醇、乙腈適量，并按照1∶1（V/V）混合均勻，用10%甲酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.0，即得。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取鹽酸拉貝洛爾對(duì)照品11.60 mg（相當(dāng)于拉貝洛爾10.42 mg），置于50 mL容量瓶中，加甲醇-乙腈混合液溶解并稀釋至刻度，得濃度為0.2084 mg/mL的儲(chǔ)備液，置于4℃冰箱中保存。精密量取儲(chǔ)備液0.1 mL置20 mL量瓶中，用甲醇-乙腈混合液稀釋至刻度，搖勻即得含拉貝洛爾濃度為1.042 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.4 樣品前處理

取待測(cè)母乳置于渦旋混合器中均質(zhì)2 min，精密量取1 mL置于10 mL離心管中，加甲醇-乙腈混合液5 mL，渦旋1 min，超聲提取 5 min，放置室溫后，用甲醇-乙腈混合液稀釋至10 mL，5000 r/min（RCF=4612×g）離心10 min，取上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液測(cè)定。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 方法專屬性 分別取空白母乳、添加了拉貝洛爾對(duì)照品溶液的空白母乳以及服藥產(chǎn)婦的母乳，按“2.4”項(xiàng)的方法處理，在“2.1”項(xiàng)的色譜及質(zhì)譜條件下測(cè)定。拉貝洛爾主要生成[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰m/z 329，定量離子為m/z 310.8，定性離子為m/z 161.8，保留時(shí)間為3.075 min，母乳中無內(nèi)源性物質(zhì)干擾，方法具有良好的專屬性。見圖1。

2.5.2 殘留效應(yīng) 精密量取1.042 μg/mL拉貝洛爾標(biāo)準(zhǔn)使用液1.0 mL置于含1 mL空白母乳的10 mL離心管中，按“2.4”項(xiàng)處理后以洗針進(jìn)樣的方式進(jìn)樣檢測(cè)后，立即將空白母乳進(jìn)樣。結(jié)果在拉貝洛爾峰保留時(shí)間處未檢出峰，表明樣品檢測(cè)不受高濃度樣品殘留影響。

2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限 精密量取1.042 μg/mL拉貝洛爾對(duì)照品溶液0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、0.8、1.0 mL分別置于各含1 mL空白母乳的10 mL離心管中，按“2.4”項(xiàng)處理，分別制成1.042、5.21、10.42、26.05、52.1、83.36、104.2 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列工作液。按“2.1”項(xiàng)的色譜及質(zhì)譜條件測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，母乳中藥物濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程Y=143.531824X+92.914980（r = 0.9988）。表明母乳中拉貝洛爾在1.042 ng/mL～104.2 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其定量下限為1.042 ng/mL，信噪比大于100。

2.5.4 精密度與準(zhǔn)確度 精密量取空白母乳1 mL至10 mL離心管中，加入0.1、0.25、0.9 mL的1.042 μg/mL對(duì)照品溶液，按“2.4”項(xiàng)處理，制備成低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度制備6份，連續(xù)測(cè)定3批，根據(jù)當(dāng)批標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品的測(cè)得濃度，考察方法的精密度與準(zhǔn)確度。見表1。批內(nèi)、批間RSD均小于15%，精密度與準(zhǔn)確度均符合“生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”（《中國藥典》2015年版四部通則9012）。

2.5.5 提取回收率 將“2.5.4”項(xiàng)的質(zhì)控樣品進(jìn)樣得到峰面積A1；另取空白母乳按“2.4”項(xiàng)處理后取上清液，配制成對(duì)應(yīng)濃度的樣品進(jìn)樣得峰面積A2，提取回收率（%）=A1/A2×100%。結(jié)果顯示，拉貝洛爾的提取回收率分別為82.2%、83.3%、92.4%。

2.5.6 基質(zhì)效應(yīng) 取拉貝洛爾對(duì)照品溶液用甲醇-乙腈混合液配制成與質(zhì)控樣品濃度一致的對(duì)照品工作液，進(jìn)樣得到峰面積A3，取“2.5.5”項(xiàng)的A2計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)=A2/A3×100%。結(jié)果顯示拉貝洛爾的基質(zhì)效應(yīng)分別為104.4%、102.4%、101.1%，表明基質(zhì)效應(yīng)不影響拉貝洛爾的測(cè)定。

2.5.7 穩(wěn)定性 配制低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品于-20℃保存，于第2、10、30天取出，在室溫下解凍后，按“2.4”項(xiàng)處理，按“2.1”項(xiàng)條件測(cè)定，計(jì)算各樣品的實(shí)測(cè)濃度與理論濃度的偏差。結(jié)果顯示，各樣品的偏差為-13.8%～2.7%，符合小于±15%的要求，表明母乳中拉貝洛爾在-20℃保存下，30 d內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.8 含量測(cè)定 本方法成功應(yīng)用于60例妊娠高血壓疾病產(chǎn)婦泌乳后首次口服鹽酸拉貝洛爾片（100 mg，q8h）母乳中拉貝洛爾的濃度監(jiān)測(cè)。分別取妊娠高血壓產(chǎn)婦泌乳后首次口服鹽酸拉貝洛爾片后0.5、1、2、3、4、6、8 h一次服藥時(shí)段（8 h/次）的乳汁，測(cè)定濃度后繪制藥-時(shí)曲線，結(jié)果顯示首次服藥后2～4 h母乳中拉貝洛爾濃度最高。見圖2。

3 討論

本研究首次建立了UPLC-MS/MS法測(cè)定母乳中拉貝洛爾的含量。本方法的特異性更好，靈敏度更高，檢出限比HPLC熒光檢測(cè)法[16]提高了10倍，比HPLC紫外檢測(cè)法[14]提高了200倍。提取液的pH=5.0時(shí)鹽酸拉貝洛爾對(duì)照品在有機(jī)溶劑中超聲30 min仍然不能完全溶解，調(diào)節(jié)pH=4.0時(shí)能完全溶解。提取液只用甲醇或者乙腈時(shí)，拉貝洛爾峰在液相色譜儀上峰形不好，改用甲醇-乙腈混合液后峰形得到改善，故選擇甲醇-乙腈混合液作為提取液。對(duì)照品溶液在1.243 min處有1個(gè)小峰，母乳樣品則沒有，文獻(xiàn)報(bào)道[17-18]拉貝洛爾有4個(gè)光學(xué)異構(gòu)體，對(duì)照品溶液的小峰可能是其同分異構(gòu)體，母乳樣品中的峰是有生物活性的同分異構(gòu)體。經(jīng)峰面積歸一化法計(jì)算，有活性的同分異構(gòu)體的百分含量為80.8%（RSD = 0.64%，n = 6）。

生物樣本在質(zhì)譜分析時(shí)容易產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)[19-23]，嚴(yán)重影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度。本研究對(duì)比了消除基質(zhì)效應(yīng)常用的凈化方法沉淀蛋白法（PPT）、液液萃?。↙LE）和固相萃取（SPE），最終選定沉淀蛋白質(zhì)后稀釋的策略[22-24]，采用甲醇-乙腈混合液直接沉淀蛋白后稀釋離心，前處理不需要萃取和富集，簡化了處理步驟，節(jié)約了前處理時(shí)間，提高了前處理效率，而且需要樣品量少，樣品采集時(shí)更容易被患者接受。“生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”（《中國藥典》2015年版四部通則9012）推薦使用質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)盡可能使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物，但因其價(jià)格昂貴，購買困難，故考察基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測(cè)定無明顯影響后，采用外標(biāo)法定量。

乳藥濃度監(jiān)測(cè)過程中發(fā)現(xiàn)，大部分妊娠高血壓產(chǎn)婦母乳中拉貝洛爾的達(dá)峰時(shí)間為服藥后2～4 h，但是個(gè)別產(chǎn)婦達(dá)峰時(shí)間為服藥后4～6 h，某些產(chǎn)婦出現(xiàn)兩個(gè)甚至多個(gè)峰濃度。這主要是由藥物在體內(nèi)過程的多重因素所致[25]，說明口服拉貝洛爾在母乳中的濃度存在個(gè)體差異，可利用本方法開展拉貝洛爾在母乳中濃度的臨床監(jiān)測(cè)[26-27]。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)婦產(chǎn)科學(xué)分會(huì)妊娠期高血壓疾病學(xué)組.妊娠期高血壓疾病診治指南[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2015，50（10）：721-728.

[2] 徐霞.拉貝洛爾治療妊娠高血壓的療效及對(duì)分娩結(jié)局的影響[J].中國實(shí)用醫(yī)藥，2016，11（22）：164-165.

[3] 莊暉.拉貝洛爾治療妊娠高血壓的療效及對(duì)分娩結(jié)局的影響[J].北方藥學(xué)，2016，13（10）：119，195.

[4] 許梅.黃芪注射液聯(lián)合鹽酸拉貝洛爾、硫酸鎂治療妊娠高血壓綜合征的效果觀察[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥，2017，24（34）：148-150，159.

[5] 高捷，朱淼，沃群聯(lián)，等.鹽酸拉貝洛爾時(shí)控緩釋微丸的研制[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2016，13（19）：26-30.

[6] 呂遙飛.妊娠期高血壓疾病的產(chǎn)科臨床治療效果分析[J]. 世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘，2017，17（42）：62-63.

[7] 崔文羨.拉貝洛爾在妊娠高血壓治療中的臨床效果以及對(duì)分娩結(jié)局的影響[J].醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐，2017，30（9）：1349-1350.

[8] 趙敏，孫瑞芳，趙學(xué)增.降壓藥物在哺乳期的合理應(yīng)用[J].中國藥物警戒，2015，12（5）：286-289.

[9] 黎文敏，陳霖.拉貝洛爾治療妊娠期高血壓疾病對(duì)母嬰預(yù)后及血清Hcy、hs-CRP水平的影響[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2016，13（2）：61-63.

[10] 史澤寧，張君嗣，鄒麗萍.哺乳期母親用藥對(duì)嬰兒安全性影響的研究進(jìn)展[J].發(fā)育醫(yī)學(xué)電子雜志，2015，3（2）：121-125.

[11] 鹽酸拉貝洛爾片中文說明書[Z].江蘇迪賽諾制藥有限公司，2014-8-25.

[12] 易小蓮，張丙宏.新生兒誤服拉貝洛爾致心力衰竭一例[J].海南醫(yī)學(xué)，2012，23（23）：142.

[13] 鄭金琪，付莉娜，劉超，等.HPLC測(cè)定鹽酸拉貝洛爾的含量及有關(guān)物質(zhì)[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2013，30（1）：86-90.

[14] 周怡，鄭金琪.HPLC法測(cè)定鹽酸拉貝洛爾注射液的含量和有關(guān)物質(zhì)[J].中國藥房，2013，24（9）：832-834.

[15] M Ganesan，S Nanjundan，Rauthan KS，et al. Rapid analysis of labetalol in human plasma using liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J]. IJPSR，2010， 1（12）：209-218.

[16] 姚藍(lán)，徐和新，苗積康，等.反相高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定血漿中拉貝洛爾的含量[J].中國藥物應(yīng)用與監(jiān)測(cè)，2005，（3）：18-20.

[17] 趙華，李惠芝，邱宗蔭.柱前手性衍生化反相高效液相色譜法分離拉貝洛爾對(duì)映體[J].色譜，1999（4）：369-371.

[18] 徐貝佳，張大同，沈報(bào)春，等.7種氨基醇類藥物在替考拉寧柱上的對(duì)映體分離[J].分析化學(xué)，2007（1）：55-60.

[19] 姚夢(mèng)侃，馬秉亮，馬越鳴.生物樣品液質(zhì)聯(lián)用分析中的基質(zhì)效應(yīng)研究概況[J].藥物分析雜志，2010，30（12）：2436-2440.

[20] 王鵬，蔣學(xué)華，王凌.LC-MSn應(yīng)用于生物樣品檢測(cè)中基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)[J].中國新藥雜志，2011，20（20）：1953-1956.

[21] 馮曉杰，杜麗英，馮章英，等.LC-MS/MS法測(cè)定人血藥濃度的基質(zhì)效應(yīng)研究進(jìn)展[J].中國新藥雜志，2015，24（13）：1488-1492，1497.

[22] 魏敏吉，李麗，張玉琥，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜在生物樣品定量測(cè)定中存在的不準(zhǔn)確因素分析和對(duì)策[J]. 中國藥學(xué)雜志，2015，50（11）：925-930.

[23] 劉曉云，陳笑艷，鐘大放.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜生物分析方法的基質(zhì)效應(yīng)和對(duì)策[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2017，38（4）：388-399.

[24] 王新宇.臨床生物樣本前處理方法的研究及臨床應(yīng)用意義[D].石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2017.

[25] 王艷，陽國平，郭成賢，等.口服給藥后藥-時(shí)曲線雙峰現(xiàn)象研究進(jìn)展[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2014，19（3）：341-345.

[26] 楊冬愛，陳琳琳.治療藥物監(jiān)測(cè)的方法學(xué)研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥科學(xué)，2016，6（8）：38-40，113.

[27] 王菁，劉璐，鄭恒，等.治療藥物監(jiān)測(cè)的研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2017，37（1）：1-8.

（收稿日期：2018-03-12 本文編輯：王 蕾）