自體富血小板血漿混合磷酸鈣骨水泥修復(fù)椎體骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究

郭瑛 賈連順 吳維敏

[摘要] 目的 觀察自體富血小板血漿（PRP）與磷酸鈣骨水泥（CPC）混合物修復(fù)椎體骨缺損的效果。 方法 選取山羊18只，在每只羊L1～L6椎體側(cè)方制備6 mm×10 mm圓柱形骨缺損。根據(jù)填充方法的不同將實(shí)驗(yàn)分為三組：實(shí)驗(yàn)組填充自體PRP復(fù)合CPC，對(duì)照組填充CPC，假手術(shù)組不填充。于術(shù)后1、3、6個(gè)月隨機(jī)處死6只，通過影像學(xué)觀察骨愈合情況。 結(jié)果 所有動(dòng)物均順利完成手術(shù)并存活。PRP中血小板數(shù)量約為全血中血小板量的5倍余，PRP中生長(zhǎng)因子[血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）]的含量明顯高于全血中生長(zhǎng)因子含量（P < 0.05）。在術(shù)后各時(shí)間節(jié)點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均有新生骨形成及骨水泥吸收，但實(shí)驗(yàn)組更明顯，而假手術(shù)組空洞未見明顯骨修復(fù)。 結(jié)論 PRP能釋放大量的生長(zhǎng)因子，與CPC混合后表現(xiàn)出很好的骨誘導(dǎo)和成骨性能。兩者混合物用于椎體骨缺損時(shí)效果確切。

[關(guān)鍵詞] 磷酸鈣；富血小板血漿；椎體骨缺損；動(dòng)物模型；羊

[中圖分類號(hào)] R683.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）09（a）-0013-05

[Abstract] Objective To observe the effect of the mixture of autologous platelet-rich plasma （PRP） and calcium phosphate cement （CPC） in repairing vertebral bone defect. Methods 18 goats were included in this experiment. A 6 mm×10 mm cylindrical bone defect was prepared on the side of lumbar vertebral body（L1-L6） of each sheep. The experiment was divided into three groups according to different filling methods： the experimental group was filled by CPC in combination with PRP， the control group was filled with CPC， and the sham operation group was not filled. 6 goats were randomly executed after surgery for 1， 3， 6 months， then the bone healing conditons were observed by imaging examination. Results All animals successfully completed surgery and survived. The platelet count in PRP was about 5 times more than that in whole blood， and the contents of growth factors [platelet derived growth factor （PDGF）， transforming growth factor-β （TGF-β）， vascular endothelial growth factor （VEGF）] in PRP were significantly higher than those in the whole blood （P < 0.05）. In all time points after surgery， new bone formation and cement absorption could be observed in both experimental group and control group， but the experimental group was more obvious， while no significant bone repair sign could be seen in sham operation group. Conclusion PRP can release a large number of growth factors， and show great properties of osteoinductive and osteogenesis when combined with CPC. The composite is effective for the treatment of vertebral bone defect.

[Key words] Calcium phosphate； Platelet-rich plasma； Vertebral bone defect； Animal model； Goat

椎體骨缺損是臨床常見的問題之一。自體骨、異體骨、生物材料等多種材料可供臨床應(yīng)用，但均有相應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)與不足。隨著微創(chuàng)技術(shù)的發(fā)展，特別是經(jīng)皮椎弓根螺釘固定以及經(jīng)皮椎體成形術(shù)、椎體后突成形術(shù)的發(fā)展，可注射性骨水泥逐漸為臨床廣泛使用。最常見的骨水泥材料為聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA），但其在固化過程中產(chǎn)生的熱量易損傷鄰近組織，增加鄰近椎體骨折的風(fēng)險(xiǎn)，沒有骨長(zhǎng)入及骨誘導(dǎo)功能，并存在潛在毒性及過敏反應(yīng)等，逐漸被認(rèn)識(shí)到其并非骨填充的最佳生物材料。磷酸鈣骨水泥（CPC）因其良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性而逐漸應(yīng)用于臨床，但其作為骨組織工程應(yīng)用的支架材料強(qiáng)度不足。而本研究試將富含各種生長(zhǎng)因子的自體富血小板血漿（PRP）混合磷酸鈣用于修復(fù)椎體骨缺損，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究經(jīng)過解放軍第一八七中心醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)院字第2016003）。海南本地山羊18只，月齡22～25個(gè)月，平均（23.67±1.28）個(gè)月，體重19～27 kg，平均（21.56±2.56）kg，雌雄不限，納入前均未施行過麻醉或因病行其他藥物治療，且排除傳染性疾病。術(shù)前常規(guī)行腰椎正側(cè)DR及CT檢查，排除病理性骨折及其他骨質(zhì)異常情況。室內(nèi)圈養(yǎng)15 d適應(yīng)觀察，發(fā)現(xiàn)體重穩(wěn)定，進(jìn)食、飲水及日?；顒?dòng)等指標(biāo)無異常，未沾染疾病后準(zhǔn)備施術(shù)，術(shù)前禁食36 h，禁飲6 h。所有動(dòng)物均購(gòu)自海南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)系動(dòng)物養(yǎng)殖中心[動(dòng)物編號(hào)SYXK（瓊）-20140017]。

1.2 PRP制作及與CPC復(fù)合

制備全程嚴(yán)格無菌。造模前用兩支預(yù)先裝有1 mL復(fù)方枸櫞酸鈉抗凝劑的10 mL注射器，分別從羊股靜脈抽取5 mL血液，一管用自動(dòng)化血液檢測(cè)儀進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)，另一管用作PRP制備，步驟如下：搖勻，置入離心管中，離心（2400 r/min）10 min，離心半徑為15 cm，重力加速度為1500 g。液體分為上清液和紅細(xì)胞兩層，吸取全部上清液及交界面以下1～2 mm的紅細(xì)胞至另一離心管，再次離心（以3600 r/min）15 min，棄上清液上3/4，剩余液體約0.8 mL，搖勻，即為PRP。依次吸入0.8 mL PRP、0.2 mL凝血?jiǎng)ㄓ? mL 10%氯化鈣與1000 U凝血酶混合而成）和少許空氣，搖勻，6～10 s后，PRP凝成膠狀物（圖1）。用血紅蛋白吸管吸取PRP 10 μL，用血小板稀釋液稀釋至2 mL后行血小板計(jì)數(shù)，余PRP與CPC按質(zhì)量比1∶10，按一定的液固比加去離子水調(diào)成骨水泥膏體。

1.3 模型制作及實(shí)驗(yàn)分組

動(dòng)物全身麻醉后取側(cè)臥位，經(jīng)腹膜后入路到過腰椎體側(cè)方，用骨科專用高速鉆頭在每只羊L1～L6椎體側(cè)方垂直矢狀位各制備一個(gè)6 mm×10 mm圓柱形骨缺損，按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)選取4個(gè)骨缺損進(jìn)行材料填充，2個(gè)假手術(shù)未行材料填充。根據(jù)填充方法的不同將實(shí)驗(yàn)分為三組：實(shí)驗(yàn)組填充自體PRP復(fù)合CPC，對(duì)照組填充CPC，假手術(shù)組不填充。

1.4 觀察指標(biāo)

分別測(cè)定全血及PRP中的血小板數(shù)量，通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）方法測(cè)定PRP中生長(zhǎng)因子[血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）]的水平。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后分別存活1、3、6個(gè)月后處死，取各椎體標(biāo)本大體觀察，并行相關(guān)檢查觀察各組骨生長(zhǎng)愈合情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用非參數(shù)Mann-Whitney U或者t檢驗(yàn)比較兩組間數(shù)據(jù)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體情況及血液分析

所有動(dòng)物均順利完成手術(shù)并存活。各時(shí)間節(jié)點(diǎn)每組分別有12個(gè)椎體可供結(jié)果分析。羊全血中血小板計(jì)數(shù)值為（224.8±32.9）×103/μL（168×103/μL～274×103/μL），PRP中血小板計(jì)數(shù)值為（1312.2±108.3）×103/μL（1150×103/μL～1527×103/μL）。PRP中血小板數(shù)量約為全血中血小板量的5倍余[484%～717%，平均（588.8±62.8）%]。PRP中生長(zhǎng)因子的含量明顯高于全血中生長(zhǎng)因子含量，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見表1。

2.2 骨缺損的修復(fù)

通過影像學(xué)觀察，術(shù)后CT觀察假手術(shù)組可見一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)圓形低密度影，而實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組可見填充物的高密度影像，1個(gè)月后骨缺損高密度區(qū)域的邊緣開始變得模糊，而假手術(shù)組仍然清晰。術(shù)后3個(gè)月，假手術(shù)組及對(duì)照組可見缺損邊緣皮質(zhì)有少許骨痂形成，但空洞內(nèi)部仍無明顯骨質(zhì)生長(zhǎng)，對(duì)照組空洞內(nèi)填充物致密影仍清晰，實(shí)驗(yàn)組空洞內(nèi)填充物邊緣逐漸模糊，骨水泥有吸收。術(shù)后6個(gè)月，假手術(shù)組與對(duì)照組缺損邊緣皮質(zhì)形成骨性連接，形成“蓋”，但假手術(shù)組內(nèi)部空洞及對(duì)照組內(nèi)骨水泥致密影仍無明顯變化，而實(shí)驗(yàn)組空洞內(nèi)骨水泥密度較前降低，邊緣模糊帶更清晰，范圍更大，且部分密度與周邊骨質(zhì)密度相同，提示部分骨缺損已修復(fù)完成（圖2）。

3 討論

椎體骨缺損是脊柱外科醫(yī)生臨床常見問題之一。造成椎體骨缺損的原因有很多種，最常見于椎體骨折，特別是老年骨質(zhì)疏松性骨折，通過外科手段恢復(fù)椎體高度實(shí)際上僅椎體外層骨皮質(zhì)復(fù)位，而被壓縮之骨小梁結(jié)構(gòu)未能恢復(fù)正常解剖結(jié)構(gòu)而留下空洞，也見于青壯年嚴(yán)重壓縮或者爆裂、椎體高度丟失明顯的骨折修復(fù)后的空腔。另外還包括脊柱腫瘤或者脊柱結(jié)核、感染等疾病行病灶清除后形成的骨質(zhì)缺損。骨組織在損傷或丟失后有一定的再生能力，以恢復(fù)正常的構(gòu)造和質(zhì)地。但當(dāng)骨缺損達(dá)到臨界大小時(shí)，常不能通過正常骨再生過程愈合，絕大部分缺損被致密的纖維連接組織填充[1]。當(dāng)缺損嚴(yán)重影響椎體強(qiáng)度及脊柱穩(wěn)定時(shí)，需要對(duì)椎體進(jìn)行填充修復(fù)。為避免此種情況發(fā)生，常需進(jìn)行骨移植。自體骨因其具有骨形成（osteogenetic）、骨誘導(dǎo)（osteoinductive）、骨傳導(dǎo)（osteoconductive）等性質(zhì)而被公認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)的骨移植材料。同時(shí)自體骨不會(huì)傳播疾病，并且在其逐步吸收為新形成的骨組織替代過程不會(huì)引起免疫反應(yīng)。但其缺點(diǎn)，如供骨量較少，取骨處相關(guān)并發(fā)癥（如術(shù)區(qū)疼痛、血腫、感染，破壞正常解剖結(jié)構(gòu)及致畸，以及增加醫(yī)療成本等）的發(fā)生限制了其應(yīng)用。因此，各種生物或合成移植材料，各類促進(jìn)骨再生的因子如生長(zhǎng)因子、骨形成蛋白（morphogenetic proteins）、生物活性多肽、骨組織工程技術(shù)和多能干細(xì)胞（pluripotent stem cells）在過去幾十年得到應(yīng)用。異體移植物是合成的有骨傳導(dǎo)性的骨替代物，其具有生物相容性好、供應(yīng)充足、無免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。生物材料必須具有多孔隙的基質(zhì)作用，能促進(jìn)目標(biāo)細(xì)胞的生長(zhǎng)及成骨分化，從而有利于骨組織在其內(nèi)部和周邊生長(zhǎng)[2]。在此過程中，生物材料中必須有能起細(xì)胞黏附作用的成分，并且必須具備合適穩(wěn)定的環(huán)境以利于骨細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化，如缺乏相關(guān)特質(zhì)，則必須與有類似功能的物質(zhì)混合。CPC是近幾年被廣泛應(yīng)用于臨床的生物相容性高的材料，其主要成分為羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA），與骨中主要無機(jī)礦物質(zhì)成分相同，因此較其他的生物材料（如氧化鋯、氧化鋁等）具有更好的骨傳導(dǎo)性，同時(shí)其發(fā)生反應(yīng)后早期形成流體，具有可注射性。隨即可形成膏狀物，可以塑性成不同的形狀，以利于對(duì)不同形狀的骨缺損進(jìn)行填充。同時(shí)其微觀下凹凸不平的表面利于各種生長(zhǎng)因子的黏附及新骨形成。通過對(duì)PRP與CPC進(jìn)行混合后的活體研究顯示，其新骨的形成速度比單純使用CPC高8%～10%[3]。但是，CPC仍然有一些缺點(diǎn)，比如其變硬后脆性增高，并且其可吸收性并不高，即使要明顯高于PMMA。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，單純CPC填充骨缺損后，6個(gè)內(nèi)吸收程度并不高，同時(shí)在吸收的部位，骨形成并不多。當(dāng)PRP加入CPC后，6個(gè)月內(nèi)雖未見骨水泥完全吸收，但是大部分被吸收的骨水泥被新生骨組織爬行替代，兩種材料復(fù)合顯示了良好的成骨性能。

PRP是一種來源方便、成本低廉和創(chuàng)傷較小的，能提供大量自體生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的血液制品。諸多生長(zhǎng)因子，像PDGF、TGF-β、血小板衍化內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（platelet-derived endothelial cell growth factor，PDEGF）、血小板源性血管形成因子（platelet-derived angiogenesis factor，PDAF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）、血小板因子4（platelet factor 4，PF-4）等，與細(xì)胞因子（cytokines）均由血小板α-顆粒分泌，能激發(fā)促進(jìn)組織修復(fù)，同時(shí)能調(diào)節(jié)這些生物活性成分的蛋白同化及分解代謝功功能之間的動(dòng)態(tài)平衡，以最優(yōu)方式利用這些活性成分促進(jìn)組織修復(fù)[4]。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)因子在合適的支架中可以影響骨細(xì)胞的趨化、分化、增殖和合適，并且調(diào)節(jié)骨的重建與重塑[5]。目前臨床及基礎(chǔ)研究亟待解決的是，如何獲得血小板中充足有效的活性成分，這也是導(dǎo)致PRP應(yīng)用研究效果不一的重要原因。目前尚無PRP統(tǒng)一的制備標(biāo)準(zhǔn)，制備方法及工藝上的差異使產(chǎn)生的細(xì)胞種類和數(shù)量不同，最后導(dǎo)致生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的成分與含量、釋放時(shí)間不同而影響最終實(shí)驗(yàn)或研究結(jié)果。目前PRP制備實(shí)驗(yàn)時(shí)主要分為一步離心法與兩步離心法，臨床主要是使用各個(gè)廠家提供的成熟設(shè)備。不管采用哪種方法與設(shè)備，保證最后PRP有充足的生長(zhǎng)因子儲(chǔ)備是最重要的條件。目前關(guān)于PRP起效時(shí)所需血小板含量尚無統(tǒng)一結(jié)論。Marx[6]認(rèn)為在臨床應(yīng)用中，只有最終形成的5 mL體積的PRP中血小板計(jì)數(shù)達(dá)到1000×103/μL時(shí)才有治療作用。但文中作者并未給出相關(guān)文獻(xiàn)依據(jù)或臨床證據(jù)。Graziani等[7]則認(rèn)為當(dāng)PRP中血小板含量比全血中血小板多2.5倍時(shí)，便能對(duì)成骨細(xì)胞及成纖維細(xì)胞產(chǎn)生積極影響。在現(xiàn)有能夠證實(shí)PRP釋放大量生長(zhǎng)因子、促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的文獻(xiàn)報(bào)道中，Mazzocca等[8]利用市售的3種不同商用PRP制備器械制備健康人血PRP，血小板計(jì)數(shù)分別為（378.3±58.64）×103/μL、（447.7±183.7）×103/μL、（873.8±207.82）×103/μL，三種PRP均能促進(jìn)7種生長(zhǎng)因子生長(zhǎng)，但數(shù)值最高組的明顯高于其他兩組，而低值的兩組則沒有差異。Bi等[9]發(fā)現(xiàn)羊血PRP中血小板數(shù)量為（1205±118）×103/μL，較全血高5倍余，能顯著促進(jìn)PDGF-BB、TGF-β1、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、VEGF等四種因子釋放。本研究與其最為接近，最終提示PRP通過CPC為支架促進(jìn)生長(zhǎng)因子的釋放，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)骨缺損內(nèi)新骨形成。

在決定PRP最終治療作用的因素當(dāng)中，PRP制備時(shí)血小板的激活是使其產(chǎn)生效果的措施中關(guān)鍵的一環(huán)[10]。血小板的激活分為兩步，血小板脫顆?；股L(zhǎng)因子從α-顆粒中釋放；接著纖維蛋白原發(fā)生分裂構(gòu)建支架，這個(gè)凝固過程促進(jìn)了血小板凝膠的形成，并且限制活性成分向指定區(qū)域趨化。血小板激活方式不但影響PRP凝固，而且不同的血小板激活方式導(dǎo)致血小板源性生長(zhǎng)因子釋放數(shù)量和釋放動(dòng)力的不同。目前用于血小板激活的引物主要有四種：氯化鈣（CaCl2）、血凝酶及兩者的結(jié)合物，以及Ⅰ型膠原。Cavallo等[11]通過采用健康人血對(duì)上述四種方式進(jìn)行對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，使用Ⅰ型膠原激活時(shí)，TGF-β1、PDGF-AB和VEGF等三種因子的數(shù)量明顯下降，而其余三種方式并無明顯差異。同時(shí)使用Ⅰ型膠原后PRP沒有凝固，而其他三種方式均在15 min內(nèi)發(fā)生凝固，并且維持至24 h。Fufa等[12]雖然在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)使用Ⅰ型膠原同樣能形成PRP凝膠，與Cavallo等[11]研究結(jié)果相反，但在生長(zhǎng)因子釋放動(dòng)力學(xué)觀察中發(fā)現(xiàn)除了VEGF早期與長(zhǎng)期釋放兩者無明顯差異外，使用CaCl2和血凝酶混合物為血小板激活物時(shí)，TGF-β1和PDGF-AB在12 h內(nèi)釋放更顯著，即使10 d內(nèi)兩者無明顯差異。但考慮到生長(zhǎng)因子的半衰期很短，只有幾分鐘到數(shù)小時(shí)，如果它們?cè)赑RP制備后不能立即從血小板釋放出來，將會(huì)被其他組織降解。而生長(zhǎng)因子的快速衰退，也將導(dǎo)致其無法很好地與去礦物質(zhì)化的骨基質(zhì)有效連結(jié)。因此本研究在制備羊血PRP中使用CaCl2和血凝酶的混合物作為血小板激活物，結(jié)果在30 min左右PRP凝固成膠體。

除了PRP的激活外，PRP的來源與制備后的療效有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)選取大型動(dòng)物山羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物，避免了采用鼠、兔等小型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)，由于小型動(dòng)物自身血容量不足，往往難以足量采血制備自體PRP，需要使用同種異體血制備。而同種異體源性血液難以保證血小板的活性，更難以確保其能分泌生長(zhǎng)因子。即使用同種異體源性血液能制備良好的PRP，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)所產(chǎn)生的抗小板抗體也將會(huì)降低PRP的活性。同時(shí)，PRP與CPC復(fù)合的比例也是影響最后結(jié)果的重要因素。一般情況下，可溶性高意味著更高的生物活性和更好的骨傳導(dǎo)性能，但同時(shí)可溶性高的材料其穩(wěn)定性較差，當(dāng)骨傳導(dǎo)還未發(fā)生時(shí)就會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的降解，從而影響最終的實(shí)際效果。Chen等[13]通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PRP與CPC粉末按重量百分率（PRP的質(zhì)量/PRP的質(zhì)量+CPC的質(zhì)量，wt%）為10%時(shí)，對(duì)PRP及CPC的彈性模量均有作用。9周后10wt%的PRP與CPC復(fù)合后相較于單純使用CPC在骨組織再生方面的活性更高。本研究采用其制備方法對(duì)PRP與CPC進(jìn)行混合，通過影像學(xué)發(fā)現(xiàn)術(shù)后6個(gè)月內(nèi)，PRP復(fù)合CPC能較單純使用CPC更好地誘導(dǎo)骨質(zhì)生長(zhǎng)，且吸收的骨水泥更好地被新生骨替代。

綜上所述，通過二次離心法能獲得高血小板含量的自體PRP。而其被CaCl2和血凝酶激活后，能釋放大量的生長(zhǎng)因子，當(dāng)將其按10wt%與磷酸鈣化骨水泥混合后，能發(fā)揮各自的優(yōu)勢(shì)，最終表現(xiàn)出很好的骨誘導(dǎo)和成骨性能。兩者復(fù)合物用于椎體骨缺損時(shí)效果確切。

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（收稿日期：2017-11-20 本文編輯：張瑜杰）