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    馬鈴薯試管苗病毒檢測技術研究

    2018-12-21 12:36梁杰李功義
    現代農業(yè)科技 2018年19期
    關鍵詞:病毒檢測

    梁杰 李功義

    摘要 根據大興安嶺馬鈴薯種薯生產實際,應用酶聯免疫吸附檢測法(ELISA)檢測莖尖組織培養(yǎng)試管苗的帶毒情況,鑒定危害馬鈴薯生產的6種主要病毒(PVX、PVY、PVS、PVM、PVA、PLRV),并結合指示植物如千日紅進行最后鑒定,篩選健康、無毒的試管苗,為切段擴繁及試管薯生產作準備。該方法簡單易操作,可作為國內生產脫毒種薯單位的標準檢測方法進行推廣。

    關鍵詞 馬鈴薯試管苗;病毒檢測;酶聯免疫吸附檢測法;指示植物接種鑒定法

    中圖分類號 S532 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739(2018)19-0081-01

    在生產上,馬鈴薯以無性繁殖為主,種植過程中容易感染病毒,并通過塊莖世代傳遞,導致病害逐年加重、馬鈴薯產量和品質下降[1]。由于脫毒苗有再侵染的可能,對基本無毒核心苗進行連續(xù)跟蹤檢測[2-3],以保證試管苗質量。對黑龍江省主栽馬鈴薯品種脫毒試管苗按株系進行檢測篩選,采用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳方法(R-PAGE),檢測主栽品種脫毒試管苗帶類病毒狀況,篩選出無類病毒的試管苗株系。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    馬鈴薯試管苗材料來源于黑龍江省大興安嶺地區(qū)農林科學院組培室,以東農303、早大白、費烏瑞它、尤金、中薯一號、大西洋、鄭薯6號、克新13號、諾蘭、中薯3號、中大一號馬鈴薯試管苗作為檢測樣品;馬鈴薯病毒檢測試劑盒購于瑞士,由蘇慶祥(博士)代購。

    1.2 儀器和設備

    聚苯烯微量滴定板(96孔)、酶聯檢測儀、微量可調進樣器(0.5~10.0 ?滋L、10.0~40.0 ?滋L、40.0~200.0 ?滋L 3個規(guī)格)及相應規(guī)格的塑料頭、電光天平(精確到0.1 mg)、冰箱、培養(yǎng)箱(溫度定為37 ℃)、瓷研缽。

    1.3 試劑及配制方法

    試劑為分析純,用水為蒸餾水。

    抗體免疫球蛋白(r-globulin)和酶標抗體(Coniugate):從某一馬鈴薯病毒抗血清提取的免疫球蛋白,用辣根過氧化物酶標記的某一病毒的免疫球蛋白的酶標記抗體,一般使用濃度常在1∶1 000以上。貯藏于4 ℃條件下備用。

    碳酸鹽包被緩沖液:pH值9.6,取無水碳酸鈉(Na2CO3)1.59 g與碳酸氫鈉(NaHCO3)2.93 g,定溶于1 L蒸餾水中。

    PBS-Tween20緩沖液:pH值7.4,用于洗滌微量滴定板。配制方法為氯化鈉(NaCl)8 g、磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.2 g、七水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·7H2O)2.2 g[或十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)2.9 g]、氯化鉀(KCl)0.2 g、迭氮化鈉(NaN3)0.2 g,加水至1 L,然后加0.5 mL Tween-20。

    樣品緩沖液為PBS-Tween20+2%PVP(聚乙烯吡咯烷酮)。底物緩沖液:0.2 mol/L Na2HPO4·12H2O溶液25.7 mL+0.1 mol/L檸檬酸溶液24.3 mL+水50 mL,pH值5.0,臨用前加鄰苯二胺40 mg、30%H2O2(過氧化氫)0.15 mL,混勻,避光放置,應為白色或微黃色溶液。

    終止液:堿性磷酸酯酶用3 mol/L NaOH中止,辣根過氧化物酶用2 mol/L H2SO4終止。

    1.4 試驗設計

    (1)酶聯免疫吸附檢測法。設定2個陰性對照A1、B1, 2 個陽性對照C1、D1,2個空白E1、F1。取東農303、早大白、鄭薯6號、費烏瑞它、尤金、中薯一號、大西洋、克新13號、諾蘭、中薯3號、中大一號馬鈴薯試管苗,每個品種取8支試管苗進行檢測,分別標記為1號、2號、3號、4號、5號、6號、7號、8號、9號、10號、11號,1號試管苗第1支記為11號、1號試管苗第8支記為18號,以此類推。

    (2)指示植物接種鑒定法。取各參試馬鈴薯品種試管苗汁液作為檢測樣品,接種于千日紅葉片,檢測6種主要病毒(PVX、PVY、PVS、PVM、PVA、PLRV)。

    1.5 操作方法

    1.5.1 酶聯免疫吸附檢測法。

    (1)包被微量滴定板。將免疫球蛋白用包被緩沖液按1∶1 000稀釋,用微量進樣器向微量滴定板的每一樣品孔內加入稀釋的免疫球蛋白200 ?滋L,在37 ℃條件下孵育4 h或在4 ℃條件下過夜。

    (2)洗滌包被的微量滴定板。甩掉微量滴定板中的免疫球蛋白稀釋液,再在一疊吸水紙上敲打微量滴定板。向微量滴定板的樣品孔中加滿洗滌液,停留3 min,甩掉洗滌緩沖液,共洗滌3次,以除盡未被吸附的免疫球蛋白。

    (3)加被檢測的樣品。在無菌條件下,從試管苗上剪下長2 cm莖段,放在小研缽內,將取樣后的試管苗放回試管中并封口,對樣品編號,以便根據檢測結果取舍。向小研缽中加樣品緩沖液,加入的量根據上樣孔數而定,研磨。每孔加200 ?滋L檢測樣品,每1塊微量滴定板上可設置陽性對照1個、空白對照1個,37 ℃孵育4 h或4 ℃條件下過夜。

    (4)顯色。洗板后,加入用樣品緩沖液1∶1 000稀釋的酶標記抗體,每孔加200 ?滋L;再洗板,然后加入底物緩沖液100 ?滋L,當一些樣品孔間顯現不同顏色時,加入50 mL終止液。

    (5)讀取結果。一是目測觀察。顯現顏色深淺與病毒相對濃度成正比。顯現白色為陰性反應,記錄為“-”;顯現淡橘紅色為陽性反應,記錄為“+”,依色澤逐漸加深記錄為“++”和“+++”。二是用酶聯檢測儀測定光密度值。樣品孔的光密度值大于陰性對照光密度值的2倍,即確定為陽性反應(陰性對照孔的光密度值應≤0.1)。

    1.5.2 指示植物接種鑒定法。2017年3月10日,用磷酸緩沖液提取試管苗汁液,用600目金鋼砂均勻噴灑在葉子表面,用脫脂棉做成小棉棒,用鑷子夾著蘸取汁液摩擦接種在千日紅(Gomphrena globosal)離體葉片上,及時用清水沖掉接種葉片上的雜物。6~7 d后,逐日觀察癥狀反應。沒有表現出明顯病毒癥狀,說明脫毒基礎苗病毒含量低或沒有。

    2 結果與分析

    2.1 酶聯免疫吸附檢測法

    檢測樣品提取液注入凹槽為200 μL,酶聯免疫吸附檢測法(ELISA)鑒定PVX病毒,只有含PVX濃度較高,超過對照陽性樣品含量,才視為含PVX。由病毒顏色反應可以看出,1號(A2-H2)、2號(A3-H3)、3號(A4-H4)、4號(A5-H5)、5號(A6-H6)、6號(A7-H7)、7號(A8-H8)、8號(A9-H9)、9號(A10-H10)、10號(A11-H11)、11號(A12-H12)馬鈴薯樣品均不含PVX。田間未發(fā)現其他幾種病毒表現出癥狀,故未檢測。

    2.2 指示植物接種鑒定法

    千日紅為鑒定PVX的最有效指示植物。試驗結果表明,接種葉片上有明顯紫紅色環(huán)狀枯斑癥狀,說明大西洋試管苗含馬鈴薯X病毒(PVX)。

    3 結論與討論

    試驗結果表明,用酶聯免疫吸附技術(DAS-ELISA)結合指示植物鑒定篩選脫毒基礎苗,方法簡單易操作,可作為國內生產脫毒種薯單位的標準檢測方法進行推廣。

    采用酶聯免疫吸附技術,從瑞士引進馬鈴薯病毒檢測試劑盒(PVX、PVY、PVS、PLRV),應用Coda全自動酶免系統(tǒng),除人工包板、研樣外,加樣、洗板、加酶標、洗板、加底物、孵育、洗板等一系列工作都在計算機操縱下進行,一次能檢測3塊板270個樣品,減少了工作環(huán)境和人為誤差,大大提高了檢測質量、速度、數量,實現了大規(guī)模種薯檢驗,保證了脫毒種薯質量[4-5]。指示植物接種鑒定法較常使用,主要根據病毒在指示植物上的癥狀,但要花費較多時間,一般為6~7 d。此外,在寄主上的癥狀表現還受環(huán)境(如溫度、光強度等)影響,會阻礙指示植物鑒定法快速對病毒病的預測,一般只作為定性檢測手段[6]。

    4 參考文獻

    [1] 吳凌娟,張雅奎,溫福君,等.馬鈴薯莖尖脫毒技術在大興安嶺種薯生產上的應用[J].中國馬鈴薯,1998(3):35-37.

    [2] 蔣先林,楊魯生,丁云雙,等.低緯高原馬鈴薯脫毒種薯標準化生產技術[J].安徽農業(yè)科學,2013,41(35):13506-13509.

    [3] 左曉斌,鄒積田.脫毒馬鈴薯良種繁育與栽培技術[M].北京:科學普及出版社,2012.

    [4] 郭志乾,吳林科,趙永峰.馬鈴薯優(yōu)良品種及配套栽培技術[M].銀川:寧夏人民出版社,2009.

    [5] 劉在東.馬鈴薯Y病毒分子檢測試劑盒的研制及株系普查[D].沈陽:東北農業(yè)大學,2008.

    [6] 張麗珍,董家紅,鄭寬瑜,等.云南省馬鈴薯脫毒試管苗和微型薯病毒檢測與分析[J].中國馬鈴薯,2015,29(1):42-45.

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