生姜脫毒快繁與病毒檢測技術研究

肖雅+雷艷+楊建國+卜曉云+肖騁+左小義

摘要 本文以感染TMV和CMV的湘西本地小黃姜為試材，采用熱處理、莖尖培養(yǎng)結合添加病毒唑的方法進行脫毒處理以獲得無病毒的優(yōu)質生姜種苗，運用RT-PCR方法檢測病毒，以期探討出生姜最適宜的脫毒快繁及病毒檢測技術。結果表明，將生姜塊莖置于40 ℃條件下催芽，顯微鏡下剝取0.2～0.5 mm的莖尖進行培養(yǎng)，最佳誘導培養(yǎng)基的配方為MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+病毒唑40 mg/L，繼代培養(yǎng)基中將MS培養(yǎng)基中的蔗糖濃度調整為80 g/L，即可實現生姜試管苗的增殖、生根及壯苗的一步培養(yǎng)，培養(yǎng)周期以30～40 d為宜。建立了一套生姜CMV和TMV 2種病毒的RT-PCR檢測體系，運用該檢測方法對生姜脫毒試管苗進行檢測，病毒檢出率為0，生姜脫毒率達100%。

關鍵詞 生姜；莖尖脫毒；同步培養(yǎng)；病毒唑；病毒檢測

中圖分類號 S632.5 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）22-0049-03

Abstract In order to obtain high quality ginger seedlings without virus，the yellow ginger of Xiangxi three main virus detoxification methods were studied.Taking TMV and CMV infection Yellow ginger of Xiangxi as experimental materials，the heat treatment，stem tip cultivation method of adding ribavirin combination，in the process of test using RT-PCR method to detect virus，the most suitable detoxification and virus detection technology of ginger were discussed.The results showed that while putting the ginger tuber for germination at 40 ℃，and then wring 0.2-0.5 mm size stem tip under the microscope for culturing.The optimal medium for induction was MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+virazole 40 mg/L.In the subculture medium，when the sucrose concentration in the MS medium was adjusted to 80 g/L，the ginger test tube′s proliferation，taking root and strong seedlings can be realized by one step，and the suitable culture cycle is 30-40 days.A RT-PCR detection system for CMV and TMV viruses was established.The virus detection rate of ginger detoxification test tube was zero by RT-PCR，ginger detoxication rate is 100%.

Key words ginger；stem tip detoxification；synchronization culture；ribavirin；virus detection

生姜為姜科姜屬多年生宿根植物，營養(yǎng)豐富，是藥、食、加工等多用途經濟作物，是我國重要的外貿產品。湘西自治州地處我國生姜主產區(qū)，生姜種植歷史悠久，全州生姜種植面積約3 333.33 hm2 [1]。生姜在生產上長期采用無性繁殖，重茬種植，易感染多種病毒，使姜體內積累多種病毒，從而導致生姜產量下降、品質降低，種性退化，嚴重制約了生姜的生產發(fā)展。國內外目前尚無高抗病毒的生姜品種和高效殺病毒藥劑，因此，亟需通過組織培養(yǎng)手段對現有優(yōu)良品種進行脫毒和復壯，提高品種自身抗逆性和增產潛力。研究表明[2-3]，侵染生姜的病毒主要為黃瓜花葉病毒（CMV）和煙草花葉病毒（TMV），病毒與姜競爭生長必需的營養(yǎng)成分，使生姜出現局部或系統(tǒng)花葉褪綠、植株矮化或葉畸形等癥狀，從而導致生姜產量降低 30%，嚴重者可減產 45%以上，且品質和抗性也會受到不同程度的影響。因此，探索出一套生姜種苗脫毒快繁體系以及病毒檢測技術是提高生姜產量和品質的有效途徑。本文以湘西小黃姜為材料，利用熱處理、莖尖培養(yǎng)及化學藥劑相結合的方法進行生姜脫毒，并用RT-PCR 檢測病毒，以期建立一套生姜脫毒快繁體系，為脫毒姜種的快速繁殖提供技術保障。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用感染TMV和CMV的湖南湘西本地小黃姜為試驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 熱處理催芽。將試驗材料置于干凈的沙盤中，上面覆蓋約3 cm厚的細沙，噴水使河沙濕潤（以沙盤內不積水為宜），河沙上用濕毛巾覆蓋，置于人工光照培養(yǎng)箱內（設置溫度：40 ℃，濕度：70%，光照：0）培養(yǎng)，4～6周后待芽長至1～2 cm時取出。

1.2.2 莖尖脫毒。待種姜芽點萌發(fā)至1～2 cm時，選取粗壯的芽，用解剖刀切下，放入器皿中用洗衣粉等清潔劑沖洗20 min，轉入超凈工作臺進行操作，將芽段放入滅菌后的燒杯內，用75%酒精清洗30 s，無菌水沖洗1次，再用0.1% HgCl溶液浸泡20 min，最后用無菌水沖洗5～6次。將完成消毒滅菌操作的生姜芽段放在無菌濾紙上吸干水分，在30～40倍解剖鏡下用無菌的解剖刀、解剖針剝取帶1個葉原基的莖尖（大小0.2～0.5 mm），將生長點迅速按無菌操作程序接入誘導培養(yǎng)基中。endprint

1.2.3 基礎誘導培養(yǎng)基篩選。據研究表明[4-7]，添加6-BA 1.0～3.0 mg/L、NAA 0.1～1.0 mg/L時，對誘導生姜的生芽分化具有很大的作用。本試驗設置12個處理（表2），記錄接種30 d后的成活率、出芽時間及出芽率，篩選出最佳的基礎誘導培養(yǎng)基。

1.2.4 不同濃度病毒唑對生姜脫毒效果的影響。以1.2.3中的基礎誘導培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，添加不同濃度的病毒唑，共設置6個處理，分別為0（B1）、5 mg/L（B2）、20 mg/L（B3）、40 mg/L（B4）、80 mg/L（B5）、150 mg/L（B6）。觀察記載每個處理的成活率和出芽率。以每個處理為一個株系，對每個株系進行擴繁，根據抽樣方法（見1.2.6）對每個株系的擴繁試管苗進行病毒檢測，統(tǒng)計每個處理下的生姜脫毒率。

1.2.5 增殖與生根培養(yǎng)基的篩選。觀察接入誘導培養(yǎng)基的芽點，待苗長至2～3 cm時，整株取出接入培養(yǎng)基中進行增殖與生根培養(yǎng)。有研究表明[8]，蔗糖濃度和培養(yǎng)時間對試管姜的誘導及膨大具有重要作用。本試驗中的增殖培養(yǎng)基以MS為基礎培養(yǎng)基，不添加任何激素，設置5個不同的蔗糖濃度處理，分別為30 mg/L（C1）、50 mg/L（C2）、80 mg/L（C3）、100 mg/L（C4）、120 mg/L（C5）。觀察記載每個處理在不同時間下的生長情況，統(tǒng)計生根誘導率及增殖倍數。

1.2.6 病毒檢測方法。采用逆轉錄-聚合酶鏈式反應法（Reverse Transcription-PCR，RT-PCR）進行病毒檢測。

檢測對象為煙草花葉病毒（Tobacco Mosaic Virus，TMV）和黃瓜花葉病毒（Cucumber Mosaic Virus，CMV）。抽樣方法：用作繁育基礎苗的每塊姜塊都必須檢測，每塊姜塊取小部分即可，其余大部分姜塊用作擴繁的脫毒材料。由一個生姜姜塊繁育而來的試管苗為同一個株系，每個株系隨機抽取1%～2%的增殖苗進行檢測，每個株系取樣3個以上。植物總RNA的提取和反轉錄方法根據TransGen Biotech公司的EasyPure RNA Kit和TransScriptR Two-Step RT-PCR SuperMix試劑盒說明書進行。PCR擴增體系：采用50 μL PCR反應體系，包含模版2 μL，正向和反向引物（根據Genebank中已報道的序列，通過Primer 5軟件設計，引物序列見表1）各2 μL，10×TransTaq-T buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，TransTaq-T DNA polymerase 0.5 μL，最后加ddH2O至50 μL。取8 μL PCR擴增產物，用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，5 V/cm恒壓條件下電泳30 min左右，在柯達凝膠成像系統(tǒng)下觀察并照相保存。根據DNA分子量標準為參照，觀察是否有目的基因大小的條帶出現。

2 結果與分析

2.1 基礎誘導培養(yǎng)基的篩選

在MS培養(yǎng)基的基礎上添加不同配比的6-BA和NAA，接種培養(yǎng)觀察，結果如表2所示。從表2可以看出，處理A3、A4、A8中，當6-BA的濃度≤NAA時，接入培養(yǎng)基的生姜芽點成活率很低，出芽率為0；當6-BA加入量為1 mg/L和3 mg/L時，無論添加多大濃度的NAA，所有處理的成活率及出芽率都很低，出芽時間長，說明低濃度的6-BA不能很好地誘導生姜芽點的萌發(fā)，高濃度的6-BA抑制生姜芽點的萌發(fā)；當6-BA加入量為2 mg/L時，處理A5、A6均有較高的成活率及出芽率，出芽時間也較短，其中以處理A6為最佳處理，接入的生姜芽點于30 d左右開始轉綠出芽，成活率高達86.7%，出芽率為83.3%，出芽時間最短。說明基礎誘導培養(yǎng)基中最佳激素配比為MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L。

2.2 不同濃度病毒唑對生姜莖尖生長及脫毒率的影響

在最佳基礎誘導培養(yǎng)基的基礎上，添加不同濃度的病毒唑，接種培養(yǎng)觀察，結果如表3所示。從表3可以看出，當培養(yǎng)基中未添加病毒唑時，生姜莖尖的成活率和出芽率最高，但脫毒率相對較低，僅為69%，說明病毒唑的加入有抑制病毒生長的作用。隨著病毒唑濃度的增加，生姜莖尖的成活率和出芽率有所下降，但脫毒率呈上升趨勢，說明病毒唑對植株的生長具有一定的抑制作用。當加入的病毒唑濃度 ≥40 mg/L時（處理B4、B5、B6），脫毒率達到100%。綜合3個測量指標，處理B4為最佳處理，脫毒率達到100%，成活率和出芽率為90%，當病毒唑濃度增加時，成活率和出芽率都有所下降，對生姜生長的抑制作用愈加明顯。

2.3 不同蔗糖濃度對生姜組培苗增殖及生根的影響

MS培養(yǎng)基中加入不同的蔗糖濃度，以期實現生姜增殖和生根的同步培養(yǎng)，接種培養(yǎng)觀察，結果如表4所示。從表4可以看出，普通的MS培養(yǎng)基（C1）中，即使生長周期達到40 d，生姜組培苗也幾乎沒有增殖，隨著蔗糖濃度的增加，生姜組培苗的增殖率和生根誘導率也越來越高。處理C3、C4、C5的的增殖倍數都較高，生根誘導率在培養(yǎng)周期為30 d時，都達到了100%，處理C4和C5試管苗的增殖和生根率雖然都較高，但均出現了葉片黃化、莖桿矮粗的現象，說明培養(yǎng)基中糖濃度過高不適宜生姜試管苗的生長。綜合比較，生姜的增殖和生根培養(yǎng)基以處理C3為最佳處理，即MS培養(yǎng)基中蔗糖濃度調整為80 g/L時，生姜試管苗的增殖率和誘導生根率達到最高，長勢也最好，實現了增殖、生根及壯苗的一步培養(yǎng)，培養(yǎng)周期以30～40 d為宜。

2.4 RT-PCR檢測生姜感病率

運用RT-PCR方法對用作繁育基礎苗的每塊姜塊進行檢測，檢測結果顯示，所檢測的樣品均出現了323 bp和237 bp的病毒特異性條帶（圖1），條帶很亮，說明本試驗的RT-PCR體系非常適合2種病毒的檢測，所有檢測的樣品呈陽性，均感染了CMV和TMV病毒，可用作進一步脫毒用的生姜材料。運用本方法對不同濃度病毒唑處理下的生姜脫毒試管苗進行檢測，檢測結果統(tǒng)計如表3所示。endprint

3 結論與討論

3.1 結論

通過對生姜脫毒方法的研究，篩選出最佳方法：運用熱處理（40 ℃）對生姜塊莖進行催芽，在顯微鏡下剝取0.2～0.5 mm的莖尖，接入誘導培養(yǎng)基中誘導出芽，最佳誘導培養(yǎng)基的配方為MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+病毒唑40 mg/L，30 d左右，芽點轉綠，50 d左右，待苗長至2～3 cm高，轉至繼代培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)基中僅僅將MS培養(yǎng)基中的蔗糖濃度調整為80 g/L，即可實現生姜試管苗的增殖、生根及壯苗的培養(yǎng)，培養(yǎng)周期以30～40 d為宜。該培養(yǎng)基配方顛覆了一般增殖及生根培養(yǎng)基必須使用激素的傳統(tǒng)，大大提高了培養(yǎng)效率，降低了生產成本。

建立了一套生姜CMV和TMV 2種病毒的RT-PCR檢測體系，運用該方法對用于脫毒的生姜試驗材料進行檢測，檢測結果出現清晰的病毒特異性條帶，說明該方法能夠快速靈敏地檢測出這2種病毒。建立了一套生姜CMV和TMV 2種病毒的RT-PCR檢測體系，運用該檢測方法對生姜脫毒試管苗進行檢測，病毒檢出率為0，生姜脫毒率達100%。

3.2 討論

3.2.1 生姜脫毒方法。目前，植物的脫毒方法主要有熱處理、莖尖培養(yǎng)和化學藥劑處理等。莖尖培養(yǎng)是目前使用最廣泛的脫毒方法，剝取的莖尖越小，脫除病毒效果越好，但同時存在成活率低下、易褐化死亡等問題，對操作人員的技術要求較高，脫毒率的高低也有一定的偶然性，因而僅以此一種方法難以達到預期的效果[9]。高溫熱處理能使病毒鈍化，抑制病毒的分化和轉移，使其失去活性。有研究表明，添加病毒唑可起到鈍化病毒、抑制病毒生長的作用，但也存在單獨使用效果不明顯的問題，需結合其他方法方可達到理想效果[10]。在生姜脫毒上通常運用前2種方法較多，有研究表明，采用高溫38 ℃催芽+超高溫50 ℃ 5 min處理姜芽，對生姜進行莖尖脫毒培養(yǎng)可使試管苗脫毒率達97.5%以上[11]，但作為生姜原原種來說，脫毒率必須達到100%。本試驗在熱處理和莖尖培養(yǎng)2種脫毒方式的基礎上添加了病毒抑制劑處理的方式，即在誘導培養(yǎng)基中添加適宜濃度的病毒唑，使擴繁的生姜脫毒試管苗的脫毒率達到100%，符合作為原原種苗的要求。

3.2.2 病毒檢測方法。ELISA是目前檢測生姜組培苗病毒的最常用方法（海南小黃姜脫毒快繁技術研究），該方法特異性強、操作簡單、適用于大量田間樣品的檢測，是目前生產應用最便捷、使用最為廣泛的檢測技術。隨著病毒檢測技術的發(fā)展，分子生物學檢測技術發(fā)展迅速，本試驗中采用的RT-PCR是一種檢測RNA病毒的行之有效的方法。該方法較ELISA而言，在檢測樣品量不太大的前提下，檢測成本更低，有研究表明，其靈敏度更是DAS-ELISA敏感度的1 000倍[12]，具有更高的準確性。脫毒后的生姜試管苗為生姜原原種苗，對脫毒率的要求特別嚴格，必須達到100%的脫毒率，才能保證后續(xù)種苗的質量，因而準確率更高的RT-PCR方法相較ELISA檢測方法來說更為合適，本試驗通過各種試驗條件的優(yōu)化，摸索了一套最適合檢測TMV和CMV 2種病毒的RT-PCR體系，可高效、準確地獲得病毒檢測結果。

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