負(fù)載生長激素脂質(zhì)體溫敏凝膠的制備及體外釋放效果

來蕾,崔永新,蘇獻雙,夏應(yīng)鋒,來慶國,李新,林桂梅

(1山東大學(xué)第二醫(yī)院，濟南250033;2 錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院;3山東大學(xué)藥學(xué)院 )

骨缺損修復(fù)重建和骨折愈合的研究一直備受口腔頜面外科醫(yī)生關(guān)注，因此，尋找一種簡單、方便和安全的促進新骨形成方法一直是很多學(xué)者關(guān)心和研究的熱點。牽張成骨術(shù)是通過持續(xù)的牽張力延長骨骼的外科手術(shù)，此技術(shù)最初被應(yīng)用于矯形外科領(lǐng)域治療短腿畸形，其后成功引入口腔頜面外科并廣泛應(yīng)用于常規(guī)手術(shù)難以治療的各種顱頜面缺損畸形治療[1]。但牽張成骨也存在著某些局限性如牽張速度受限、治療周期相對較長、牽張過快過長時會導(dǎo)致新骨形成不良等問題。有很多方法都被嘗試用于促進牽張成骨，主要包括細胞因子的局部應(yīng)用、干細胞治療、基因治療和物理療法等[2]。有研究表明，生長激素(GH)促進成骨功能十分強大，對骨骼的生長發(fā)育至關(guān)重要。研究證明，通過皮下注射全身應(yīng)用外源性GH能促進牽張成骨新骨形成和礦化[3，4]，這與以往研究中需要在牽張間隙多點注射相比較，具有使用方便，操作過程簡單快捷，劑量可控性強，藥劑來源廣泛等優(yōu)點。一直以來，凝膠材料在藥劑學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注，研發(fā)者根據(jù)臨床需要不斷地創(chuàng)新，目前臨床上常用的植入釋藥的溫敏凝膠有異丙基丙烯酰胺共聚物、嵌段聚合物以及多糖/鹽體系三種[5,6]。溫敏凝膠屬于智能型凝膠的一種，具有對環(huán)境溫度變化敏感的特點，當(dāng)處于溶膠狀態(tài)時可以根據(jù)需要隨意添加不同性質(zhì)的藥物[7]，以溶液形式給藥以后，在周圍環(huán)境溫度升高后即發(fā)生溶膠-凝膠的相轉(zhuǎn)變，從而實現(xiàn)了藥物緩慢釋放且長效的目的。2017年1～12月，本課題組探討了以磷脂酰乙醇胺(PE)、膽固醇，油酸制備GH脂質(zhì)體，并將制備的脂質(zhì)體負(fù)載到溫敏凝膠中的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料 主要試劑：GH(海濟生物技術(shù)有限公司),大豆磷脂 (北京奧博星生物技術(shù)有限公司),磷酸氫二鈉(天津博迪化工股份有限公司),考馬斯亮藍(國藥集團化藥試劑有限公司),膽固醇(濟南岱罡生物技術(shù)有限公司),乳酸-乙醇酸(PLGA)-聚乙醇(PEG)-PLGA(濟南岱罡生物技術(shù)有限公司)。主要儀器：EL204電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)，DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，N-1001型EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛郎儀器有限公司)，JEM-100CXⅡ型透射電子顯微鏡(日本電子公司)，DelsaTM Nano系列Zeta電位和粒徑測定儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)，透析袋(截留分子量8 000)(北京索萊寶科技有限公司)，UV-2102PCS紫外分光光度計(上海尤尼柯儀器有限公司)。

1.2 GH含量的測定 采用考馬斯亮藍法。精密稱量GH 3.2 mg，充分溶解于磷酸鹽緩沖液(PBS)，并稀釋為1.6 mg/mL儲備液。取PBS 200 μL與馬斯亮藍溶液900 μL考充分混合，渦旋10 s，在400～700 nm波長范圍內(nèi)掃描,以其為空白溶液，取GH溶液200 μL經(jīng)同樣方法處理，在610 nm處有最大吸收。因此確定GH的檢測波長為610 nm。標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：精密量取GH儲備液，稀釋成5、10、20、30、50、70、100 μg/mL系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以所選溶劑為空白，于選定吸收波長610 nm處測定吸光度值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定線性范圍。精密度實驗：將低中高(10、30、70 μg/mL)三個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液放置于室溫下，于610 nm波長處測定吸收度。分別于一天內(nèi)測定5次，求得日內(nèi)精密度?；厥章蕦嶒灒悍Q取GH適量，加入PBS(pH 7.4)溶解，定容后制成濃度分別為10.0、30.0、70.0 μg/mL的低、中、高三水平溶液，各3份。于610 nm波長處測定吸收度。計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3 負(fù)載GH脂質(zhì)體的制備 精密稱取磷脂與GH以6∶1比例溶解于氯仿，加入一定體積的緩沖液，探頭超聲9 s，形成o/w相，在35 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)有機溶劑，在45 ℃下水化45 min。量取脂質(zhì)體混懸液1 mL，10 000 r/min離心10 min，取200 μL加入考馬斯亮藍溶液900 μL，在610 nm處測定吸收度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算含量，此含量為游離藥物?？偹幜恳钥偼端幜繛闇?zhǔn)。包封率=總藥量-游離藥物/總藥量×100%。

1.4 負(fù)載GH脂質(zhì)體的鑒定 藥脂比的影響：分別精密量取磷脂酰膽堿儲備液900 μL (10 mg/mL),800 μL,480 μL,240 μL，總膽固醇儲備液(5 mg/mL)與磷脂酰膽堿的質(zhì)量比保持3∶1，加入氯仿至3 mL中，加入1.6 mg/mL GH 1mL，使磷脂與藥物的比值分別為6∶1、5∶1、3∶1、3∶2，置于超聲儀中18 s，將混合物置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中去除有機溶劑，在55 ℃的PBS中水化30 min。超聲時間：精密量取磷脂酰膽堿儲備液900 μL(10 mg/mL)，總膽固醇儲備液600 μL(5 mg/mL)，加入氯仿至3 mL中，加入1.6 mg/mL GH1 mL，置于超聲儀中9、18、36 s，將混合物置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中去除有機溶劑，在55 ℃的PBS中水化30 min。水化溫度：分別在30 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃的PBS中水化30 min。水化時間：分別在55℃的PBS中水化30、45、60 min。重復(fù)性實驗：通過單因素的考察，將獲得最高包封率的因素進行組合。精密量取磷脂酰膽堿儲備液900 μL(10 mg/mL)，總膽固醇儲備液600 μL(5 mg/mL)，加入氯仿至3 mL中，加入1.6 mg/mL GH1 mL，置于超聲儀中9 s，將混合物置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中去除有機溶劑，在45 ℃的PBS中水化45 min。利用動態(tài)光散射原理，對脂質(zhì)體的粒徑和分布進行測定。檢測Zeta電勢。

1.5 含有GH脂質(zhì)體凝膠的制備 首先選用試管倒置法檢測本凝膠相轉(zhuǎn)變溫度。配制一系列不同濃度三嵌段共聚物PLGA-PEG-PLGA聚合物溶液(10%、15%、20%、25%、30%、w/w ),取2 mL置于具塞試管中,并把試管放進水浴中，使水的液面高于聚合物溶液，水浴從15 ℃開始緩慢升溫，每隔0.5 ℃將試管傾斜180°以便觀察溶液的流動情況。溶液不流動時的溫度即凝膠溫度。每個樣品測定3次，取其均值。精密稱取PLGA-PEG-PLGA聚合物適量置于燒杯中，在攪拌下加入定量的蒸餾水，繼續(xù)攪拌直至聚合物均勻分散，置于4 ℃冰箱內(nèi)保存使凝膠充分溶脹、溶解即可得到無色透明的PLGA-PEG-PLGA聚合物凝膠溶液。將一定量的負(fù)載GH脂質(zhì)體在攪拌下緩慢加入溶脹完全的空白聚合物凝膠PLGA-PEG-PLGA溶液中，繼續(xù)攪拌均勻即得含有藥物的凝膠。

1.6 GH脂質(zhì)體凝膠體外釋放度的測定 采用無膜擴散法測定。藥物從凝膠中的釋放，對比游離藥物凝膠和負(fù)載藥物脂質(zhì)體凝膠在PBS中的釋放度。將1.0 mL游離藥物和載有藥物的脂質(zhì)體在攪拌下分別緩慢加入到溶脹完全的空白聚合物凝膠PLGA-PEG-PLGA溶液中，37 ℃下形成凝膠，加入PBS (pH 7.4) 10 mL，隨后將裝有凝膠的試管放置于恒溫振蕩儀中，將溫度控制在(37±0.5)℃,轉(zhuǎn)速為100 r/min。整個溶出的過程將試管密封。在30 min，1、2、4、6、8、10、12 h等設(shè)定的取樣時間點取樣，取樣量為1.0 mL，同時補充恒溫的新鮮PBS介質(zhì)1.0 mL，樣品經(jīng)處理后于610 nm用UV測定，計算累積釋放度。

2 結(jié)果

2.1 GH脂質(zhì)體制備方法的有效性 依據(jù)考察單因素得出的處方為將磷脂與GH以6∶1比例配比，探頭超聲9 s，形成o/w相，在35 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)有機溶劑，在45 ℃下水化45 min。為驗證該處方具有較高的包封率和方法的重現(xiàn)性，制備脂質(zhì)體5份，算出包封率和載藥量，5份脂質(zhì)體的包封率分別為96.22%、97.88%、97.88%、96.22%、96.93%，載藥量分別為11.3%、11.54%、11.54%、11.37%、11.44%。通過多次重復(fù)實驗發(fā)現(xiàn)，制備的脂質(zhì)體包封率和載藥量均較高，包封率和載藥量的變化并不大，方法具有較好的重現(xiàn)性。脂質(zhì)體主要分布在567 nm左右，具有較好的分散度(PdI=0.326)，Zeta電勢在-15.48 mV。

2.2 聚合物溶液相轉(zhuǎn)變溫度 通過制備一系列濃度的PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物溶液，測定其轉(zhuǎn)變成凝膠的溫度。10%、15%、20%、25%、30%濃度的聚合物相轉(zhuǎn)變溫度分別為34.0 ℃ 、34.5 ℃、32.5 ℃、32.5 ℃、31 ℃。隨著濃度的增加，相轉(zhuǎn)變溫度逐漸降低。當(dāng)質(zhì)量濃度低于10%時，在37 ℃不能形成凝膠，不具有繼續(xù)研究的價值。質(zhì)量比為30%或高于30%時聚合物的水溶液較黏稠，一定程度上會影響通針性，最終選擇15%為制備凝膠的濃度，向其中加入不同量的脂質(zhì)體或游離藥物。其溶液-凝膠相轉(zhuǎn)變溫度為34.5 ℃，且通針性較好，溶液狀態(tài)澄清透明。

2.3 GH脂質(zhì)體凝膠體外釋放度 對比游離藥物凝膠和負(fù)載藥物脂質(zhì)體凝膠在緩沖溶液中的釋放度發(fā)現(xiàn)，藥物具有透過PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)釋放的作用，從30 min開始釋放，24 h的累積釋放度到47.28%。見圖1。GH脂質(zhì)體凝膠的釋放曲線表明，藥物在8 h達到最大值。見圖2。

圖1 游離藥物凝膠的釋放曲線

圖2 負(fù)載GH脂質(zhì)體凝膠的釋放曲線

3 討論

牽張成骨術(shù)是目前國內(nèi)外口腔頜面外科領(lǐng)域研究較多的一種新型技術(shù)，牽張成骨的基礎(chǔ)是在牽張間隙內(nèi)能產(chǎn)生并形成形態(tài)和質(zhì)地均較好的新的骨組織。有研究[8]表明，牽張成骨在新骨生成的同時也會有胚胎的發(fā)育、新生兒骨生長以及骨折愈合等方面的生物學(xué)特征。但由于牽張成骨的治療時間較長和可能存在骨再生不良等問題以及患者本身骨質(zhì)不良時都影響了該技術(shù)的治療效果。因此，目前尋找促進新骨形成的方法已成為很多學(xué)者們研究的熱點。在我們前期的研究中發(fā)現(xiàn)，骨牽張部位在創(chuàng)傷和牽張力的作用下，局部存在低氧和缺血的情況，細胞間質(zhì)液會出現(xiàn)異常酸化現(xiàn)象，表現(xiàn)為pH值降低。因此，我們設(shè)想，可以利用成骨部位pH值比正常組織低的特性，制備一種在生理范圍內(nèi)穩(wěn)定而在pH偏低的環(huán)境中不穩(wěn)定的pH敏感型載體材料，以減少不良反應(yīng)。PE為一種天然存在的不飽和磷脂，能夠形成雙層相和六角相，且兩相之間轉(zhuǎn)變時焓變極小。以PE為主要磷脂材料制備的脂質(zhì)體能夠在兩相轉(zhuǎn)變時產(chǎn)生pH敏感性，但是由于其pH敏感性較弱一直未被深入研究。因此，我們擬將具有pH敏感性的小分子物質(zhì)油酸、膽固醇和PE混合制備成pH敏感脂質(zhì)體，提高其pH敏感性?；旌喜牧暇鶠樘烊淮嬖诋a(chǎn)物，在人體內(nèi)可自行進行生物降解，具有較好的生物相容性和安全性，相對合成材料價格較低，開發(fā)這一制劑具有極好的前景。

然而脂質(zhì)體作為自組裝微粒分散制劑，存在易絮凝、藥物易泄露等方面的問題，即脂質(zhì)體的儲存及體內(nèi)穩(wěn)定性欠佳。高分子聚合物藥物載體具有良好的穩(wěn)定性，將高分子聚合物的藥物載體和基于脂質(zhì)的藥物載體適當(dāng)結(jié)合，可制備得到包覆脂質(zhì)體。包覆材料的結(jié)合能夠增加脂質(zhì)體雙層膜的穩(wěn)定性，延長脂質(zhì)體在體內(nèi)的存留時間和脂質(zhì)體中藥物的釋放速度[9]。因此，我們設(shè)想將GH脂質(zhì)體負(fù)載在凝膠中，對其進行二次包封，以期達到理想的緩釋效果。

簽于目前大部分緩釋載體系統(tǒng)需要手術(shù)才能植入目標(biāo)處，因而我們設(shè)想使用一種可注射型緩釋載體系統(tǒng)以方便臨床應(yīng)用。殼聚糖基可注射型溫度敏感性水凝膠，在常溫下為液體狀態(tài)，注射入機體后隨體溫的升高，凝膠由液態(tài)變?yōu)楣虘B(tài)。此種材料是一種pH值中性的物理水凝膠，與人體內(nèi)環(huán)境的酸堿度接近，并避免有機化學(xué)試劑及其他有害的物質(zhì)，適合于敏感大分子如蛋白質(zhì)及肽類藥物的運載。能用于藥物緩釋載體的可注射材料中，殼聚糖與甘油磷酸鈉體系(CS/GPS)是研究最多的，它可用于軟組織工程[10,11]。該體系中的甘油磷酸鹽也是公認(rèn)的無毒生物相容性物質(zhì)，因此CS/GPS體系具有良好的研究和應(yīng)用前景。

pH敏感性脂質(zhì)體作為一種新型的納米靶向載體，由一種或多種對外部pH變化敏感的脂質(zhì)和兼性穩(wěn)定劑組成，在酸性環(huán)境中不穩(wěn)定。當(dāng)外部環(huán)境pH變化時(即從中性向酸性pH變化時)，pH敏感脂質(zhì)體即與內(nèi)吞膜融合，將內(nèi)容物釋放至胞質(zhì)[12]。羧甲基殼聚糖(CMCT)既含有陽離子(-NH})基團，又含有陰離子(-COO-)基團，是一種兩性聚電解質(zhì)，具有特殊的pH敏感性。鏈上富含的極性基團能在脂質(zhì)體表面形成親水層,可以逃避血液中網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的捕獲。當(dāng)介質(zhì)偏酸性時，CMCT因荷電分子鏈鏈間靜電相互作用加強，加上鏈內(nèi)氫鍵與疏水基團相互作用，CMCT分子鏈構(gòu)象產(chǎn)生轉(zhuǎn)變，分子鏈卷曲程度逐步增加，形成線團。隨pH升高，CMCT分子內(nèi)羧基被中和形成羧酸根負(fù)離子，負(fù)電荷間的相互排斥使CMCT采取松散線團構(gòu)象。若將CMCT結(jié)合于脂質(zhì)體表面，由于環(huán)境pH變化引起CMCT構(gòu)象的改變，會迫使磷脂雙分子層發(fā)生重排，破壞脂質(zhì)體膜的屏障性質(zhì)，從而使內(nèi)容物迅速釋放，便可以實現(xiàn)pH敏感控釋。

牽張成骨的本質(zhì)是骨折愈合和骨組織的再生過程，與單純骨缺損的修復(fù)相比，它的過程存在更加復(fù)雜的炎癥反應(yīng)，局部低氧嚴(yán)重，組織在局部缺血時，細胞內(nèi)和間質(zhì)液出現(xiàn)異常酸化現(xiàn)象，pH值比普通的骨折創(chuàng)傷更低更持久。因此，我們設(shè)想，首先將羧甲基殼聚糖結(jié)合于脂質(zhì)體表面，構(gòu)建具有pH敏感的納米脂質(zhì)體載體，然后用這種pH敏感納米脂質(zhì)體包裹GH，制備出pH敏感鈉米脂質(zhì)體包裹的GH。利用牽張成骨區(qū)域pH低于正常組織特點，通過皮下注射全身應(yīng)用pH敏感鈉米脂質(zhì)體包裹的GH，進入血液循環(huán)后在低pH值的牽張成骨區(qū)域釋放出GH并發(fā)揮作用，而在身體其他部位保持穩(wěn)定，實現(xiàn)GH靶向歸巢于牽張成骨區(qū)域，促進牽張成骨新骨形成和礦化。這樣不但可以使得健康組織免受藥物潛在不良作用的威脅，而且可以進一步提高靶向性，實現(xiàn)藥物的智能控制釋放。

本研究結(jié)果顯示，8 h之前釋放藥物主要為制備脂質(zhì)體過程中未包裹的藥物，這一現(xiàn)象和所計算所得脂質(zhì)體的包封率相吻合。主要是脂質(zhì)體對藥物有一定的保護作用，從而使延緩了藥物的釋放。由于GH穩(wěn)定性較差，在這一過程中，藥物降解速度超過藥物釋放速度，因此累積釋放率出現(xiàn)下降趨勢。脂質(zhì)體在12 h后逐漸破壞，藥物釋放加快，累積釋放度逐漸增加。本實驗結(jié)果可見，凝膠和脂質(zhì)體對藥物有雙重保護作用，可以起到很好的緩釋效果。超過24 h后測量藥物的累積釋放度低于47.28%?？赡茉蚴荊H在24 h之后發(fā)生降解，導(dǎo)致測量值偏低，使累積釋放度不準(zhǔn)確，不能直觀表現(xiàn)藥物釋放的具體情況。從現(xiàn)有游離藥物從凝膠中的釋放曲線可以看出，凝膠具有控制藥物緩慢釋放的作用，從而延長藥物作用時間。

比較負(fù)載GH脂質(zhì)體凝膠與游離藥物凝膠的釋放度發(fā)現(xiàn)，載藥物脂質(zhì)體凝膠中的藥物釋放比游離藥物凝膠釋放緩慢。可能的原因有以下幾點：①藥物包裹成脂質(zhì)體之后粒徑增大，比游離藥物分子大，不能自由地透過凝膠，有效地延緩了藥物的釋放；②PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物不同分散區(qū)域分散不同溶解度的藥物，對于水溶性高的藥物主要分散在聚合物的親水端(PEG端)，藥物的釋放以擴散為主；而脂溶性藥物則在聚合物的疏水端(PLGA端)，需經(jīng)過與PLGA端的解離擴散或者溶蝕才能得到釋放。包裹藥物成為脂質(zhì)體之后，藥物的脂溶性增加，在凝膠中趨向于PLGA端，延緩了藥物的釋放；③GH作為一類水溶性蛋白質(zhì)，通常存在于脂質(zhì)雙分子層的內(nèi)部水相中，能夠很好地得到保護，也在一定程度上延緩了其的釋放。

綜上所述，本實驗證明負(fù)載GH的脂質(zhì)體凝膠比游離GH凝膠更具有緩釋作用，為后續(xù)這一制劑的研究提供了前期的理論基礎(chǔ)，也為研究和開發(fā)高效低毒的蛋白藥物新劑型提供重要的實驗和理論依據(jù)。