糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血漿中miR-21、miR-93的水平變化及臨床意義

李雷，唐平

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,?？?70102)

糖尿病視網(wǎng)膜病變屬于糖尿病患者最常見的并發(fā)癥之一，其主要發(fā)病機(jī)制為糖尿病損害視網(wǎng)膜上的毛細(xì)血管，從而使得周圍組織水腫、出血，甚至毛細(xì)血管阻塞，進(jìn)一步導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺血、缺氧，促進(jìn)新的增殖物產(chǎn)生，導(dǎo)致視網(wǎng)膜病變[1]。有研究報(bào)道證實(shí)，隨著糖尿病患者病程增加，視網(wǎng)膜病變的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)越高[2]。因此，對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變患者進(jìn)行早期有效的診斷和治療顯得尤為重要。隨著近年相關(guān)研究的深入，越來(lái)越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)微小核糖核酸(miRNA)參與了細(xì)胞的增殖、分化以及凋亡等過(guò)程，且miR-21與miR-93在眼部疾病中的表達(dá)明顯異常，可能成為眼部疾病診斷、治療的新靶點(diǎn)[3]。鑒于此，本文探討了糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血漿中miR-21、miR-93的水平變化并分析了其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年2月～2018年2月海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治的糖尿病視網(wǎng)膜病變患者109例(視網(wǎng)膜病變組)。其中男61例、女48例，年齡32～78(57.32±10.52)歲。另取本院收治的單純糖尿病患者100例(單純糖尿病組)，其中男57例、女43例，年齡31～80(57.40±10.47)歲。再取同期于本院進(jìn)行體檢的健康人員100例作為對(duì)照組，其中男54例、女46例，年齡30～77(57.27±10.38)歲。三組性別、年齡比較，P均>0.05。納入標(biāo)準(zhǔn)[4]：糖尿病患者均符合1999年世界衛(wèi)生組織糖尿病專家委員會(huì)提出的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；糖尿病視網(wǎng)膜病變患者均符合臨床眼科影像學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)；年齡>20歲；臨床病歷資料完整；入院前均未接受相關(guān)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并心、肝、腎等臟器功能嚴(yán)重障礙者；伴有急慢性感染性疾病、惡性腫瘤以及心腦血管疾病者；存在精神疾病或交流溝通障礙者。三組患者及其家屬均簽署知情同意書，本院倫理委員會(huì)已批準(zhǔn)。

1.2 觀察指標(biāo)及其檢測(cè)方法 三組入院后均采集清晨空腹靜脈血10 mL，以3 000 r/min離心10 min，分別取血清與血漿保存于-80 ℃冰箱中待檢。常規(guī)生化指標(biāo)的檢測(cè)：血漿甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平：采用日立7060全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定；空腹血糖(FPG)水平：采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)；血漿糖化血紅蛋白(HbA1c)：采用高效液相色譜法測(cè)定；血漿內(nèi)酯素、抵抗素以及瘦素水平：采用脂肪因子免疫酶聯(lián)吸附法測(cè)定，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，相關(guān)試劑盒均購(gòu)自日本SHINO-TEST公司。血漿miR-21、miR-93水平的檢測(cè)：采用德國(guó)Qiagen公司的miRNeasy血漿提取試劑盒提取血漿總miRNA。采用ABI 7500型熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，內(nèi)參為U6，miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包括RNA模板5 μL，U6 3 μL，miRNA特異性莖環(huán)引物3 μL，100 mmol/L的脫氧核糖核苷酸0.15 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，RNase抑制劑0.19 μL，無(wú)菌三蒸水4.16 μL。反應(yīng)條件如下：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，保存于4 ℃中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以U6為內(nèi)參，擴(kuò)增條件如下：95 ℃ 10 min ，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s共40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，根據(jù)公式2-ΔΔCt計(jì)算miRNA相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 三組各項(xiàng)臨床生化指標(biāo)水平對(duì)比 視網(wǎng)膜病變組FPG、HbA1c、抵抗素、瘦素水平均高于單純糖尿病組與對(duì)照組，而內(nèi)酯素水平均低于單純糖尿病組與對(duì)照組；且單純糖尿病組FPG、HbA1c水平均高于對(duì)照組(P均<0.05)，見表1。

表1 三組各項(xiàng)臨床生化指標(biāo)水平對(duì)比

注：與對(duì)照組相比，#P<0.05；與單純糖尿病組相比，*P<0.05。

2.2 三組血漿miR-21、miR-93表達(dá)水平比較 視網(wǎng)膜病變組血漿miR-21與miR-93表達(dá)水平均高于單純糖尿病組與對(duì)照組(P均<0.05)，見表2。

表2 三組血漿miR-21與miR-93表達(dá)水平比較

注：與對(duì)照組相比，#P<0.05；與單純糖尿病組相比，*P<0.05。

2.3 糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血漿miR-21、miR-93與各生化指標(biāo)的相關(guān)性分析 Preason相關(guān)性分析結(jié)果顯示，糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血漿miR-21、miR-93分別與FPG、HbA1c、抵抗素、瘦素呈正相關(guān)(r分別為0.503、0.625、0.679、0.636，0.485、0.613、0.684、0.627；P均<0.05)，而與內(nèi)酯素均呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.608、-0.583，P均<0.05)。

2.4 糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生的多因素分析 多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，血漿FPG、HbA1c、抵抗素、瘦素及miR-21、miR-93均是糖尿病視網(wǎng)膜病變的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而內(nèi)酯素為保護(hù)性因素(P均<0.05)。見表3。

表3 糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生的多因素Logistic回歸分析

3 討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變屬于糖尿病嚴(yán)重并發(fā)癥之一，該病會(huì)對(duì)患者的視功能造成一定程度的損害，從而導(dǎo)致視物模糊不清、甚至突然視物不見等多種臨床癥狀，對(duì)患者的生活質(zhì)量造成了嚴(yán)重影響[5，6]。因此，早期有效的監(jiān)測(cè)以及治療顯得尤為重要。miRNA屬于內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，在視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)具有特異性[7，8]。有研究報(bào)道顯示，miRNA可能是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等機(jī)制參與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[9，10]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜病變組FPG、HbA1c、抵抗素、瘦素水平均高于單純糖尿病組與對(duì)照組，而內(nèi)酯素水平均低于單純糖尿病組與對(duì)照組；且單純糖尿病組FPG、HbA1c水平均高于對(duì)照組，提示視網(wǎng)膜病變患者FPG、HbA1c、抵抗素、瘦素水平存在明顯高表達(dá)，而內(nèi)酯素水平存在明顯低表達(dá)。內(nèi)酯素在機(jī)體內(nèi)屬于血清調(diào)節(jié)因子，在糖脂代謝與炎癥反應(yīng)以及免疫應(yīng)答過(guò)程中起著重要作用，其水平的不足會(huì)導(dǎo)致機(jī)體血糖調(diào)節(jié)異常，對(duì)眼部微血管具有較大的損害作用，并可進(jìn)一步加重患者的病情以及視網(wǎng)膜病變程度[11]。抵抗素屬于炎癥細(xì)胞因子之一，具有促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放以及調(diào)節(jié)血管功能的作用，其含量增多會(huì)增加血管通透性，從而增加了水腫、蛋白尿以及臟器損傷的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，最終加重糖尿病所致眼部微血管病變損傷[12]。瘦素則可對(duì)血管生成以及血小板凝聚造成影響，同時(shí)具有較強(qiáng)的血管收縮效應(yīng)，可導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管壓力升高，進(jìn)一步引發(fā)視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮受損，最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜病變發(fā)生[13]。此外，本研究結(jié)果顯示，視網(wǎng)膜病變組血漿miR-21與miR-93表達(dá)水平均高于單純糖尿病組與對(duì)照組，提示視網(wǎng)膜病變組患者機(jī)體的miR-21以及miR-93表達(dá)水平更高。符春艷等[14]研究顯示，miR-21以及miR-93的表達(dá)可能在糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。有研究報(bào)道顯示，多種miRNA表達(dá)水平在急性光誘導(dǎo)視網(wǎng)膜損傷小鼠中升高，其可能是通過(guò)增加糖尿病中細(xì)胞外基質(zhì)纖維連接蛋白，進(jìn)一步促進(jìn)糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生[15，16]。因此，miR-21與miR-93可能參與了糖尿病視網(wǎng)膜病變的進(jìn)展。另外，多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，F(xiàn)PG、HbA1c、抵抗素、瘦素與血漿miR-21、miR-93均是糖尿病視網(wǎng)膜病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而內(nèi)酯素為保護(hù)性因素。提示上述因素均參與了糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生，臨床上可通過(guò)針對(duì)上述因素制定相關(guān)干預(yù)措施，從而有效降低糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，經(jīng)Pearson相關(guān)性分析可得，糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血漿miR-21、miR-93與FPG、HbA1c、抵抗素、瘦素均呈正相關(guān)，而與內(nèi)酯素均呈負(fù)相關(guān)。這也再次證實(shí)了糖尿病視網(wǎng)膜病變患者病情越重，血漿miR-21、miR-93表達(dá)水平越高，兩者可能成為臨床上判斷糖尿病視網(wǎng)膜病變患者病情嚴(yán)重程度的有效指標(biāo)。

綜上所述，糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血漿miR-21、miR-93均存在明顯高表達(dá)，此二者可能參與了病情進(jìn)展。臨床工作中可通過(guò)對(duì)兩項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，從而早期診斷糖尿病視網(wǎng)膜病變。