宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中CD44v6、LYVE-1表達(dá)與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系

周小慶

(沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院，沈陽(yáng)110024)

宮頸癌是常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，發(fā)病率居高不下，且近年有年輕化趨勢(shì)[1]。我國(guó)宮頸癌發(fā)病率位于世界第二，每年新發(fā)病例約13.2萬(wàn)例，約占世界宮頸癌新發(fā)病例總數(shù)的28%[2]。為減輕宮頸癌對(duì)婦女健康的威脅，早期診斷、合理制定臨床治療方案尤為重要。宮頸癌的組織分型多為鱗狀細(xì)胞癌與腺癌，其中又以鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病率最高。白細(xì)胞分化抗原44號(hào)拼接變異體v6(CD44v6)蛋白是一種表面跨膜黏附分子，在生物體內(nèi)廣泛分布，在細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的特異性黏附過(guò)程中起重要作用[3]。目前普遍認(rèn)為，CD44v6基因的表達(dá)能夠影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)能力[4]，因而將其作為一項(xiàng)可能的預(yù)測(cè)腫瘤患者預(yù)后的生物標(biāo)記物。淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞透明質(zhì)酸受體-1(LYVE-1)是一類生物體內(nèi)高度同源的分子，也能作為腫瘤組織淋巴管的特異標(biāo)志[5]。本研究利用免疫組化(SP法)檢測(cè)CD44v6與LYVE-1蛋白在宮頸組織中的表達(dá)，旨在探討宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中CD44v6與LYVE-1的表達(dá)變化及意義，希望能為臨床診療方案的制定提供新的參考方向。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2007年10月～2012年3月沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院宮頸活檢、手術(shù)取得的宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者腫瘤組織標(biāo)本78例份，患者年齡31～69(52.21±8.49)歲，其中年齡≤50歲者34例，>50歲者44例；FIGO分期：Ⅰ期30例，Ⅱ期48例；腫瘤直徑：≤4 cm者45例，>4 cm者33例；組織學(xué)分化程度：低分化者38例，高、中分化者40例；肌層浸潤(rùn)深度：≤1/2肌層者32例，>1/2肌層者46例；無(wú)淋巴管浸潤(rùn)者64例，有淋巴管浸潤(rùn)者14例；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者59例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者19例。宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變組織47例份，患者年齡26～71歲、中位年齡56歲，其中低度病變26例、高度病變21例；正常宮頸組織32例份，年齡35～62歲、中位年齡54歲。所有標(biāo)本經(jīng)病理科檢驗(yàn)確診后，常規(guī)石蠟包埋，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱中備用。本研究涉及患者臨床資料完整，之前均未接受放療、化療等其他抗腫瘤手段治療。本研究事先經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，全程操作符合相關(guān)規(guī)定。

1.2 宮頸組織CD44v6與LYVE-1蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用免疫組化(SP)法。取保存的宮頸組織石蠟標(biāo)本4 μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟水化，嚴(yán)格按照SP法試劑盒說(shuō)明書操作。鼠抗人CD44v6單克隆抗體(BioSSTM)、兔抗人LYVE-1多克隆抗體(BioSSTM)、免疫組化(SP)法試劑盒(eBioscienceTM)均購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司。經(jīng)65 ℃烤片20 min，常規(guī)梯度乙醇脫水，PBS沖洗3次，95 ℃水浴修復(fù)抗原，PBS沖洗3次，正常血清封閉。用PBS作為陰性組一抗，DAB染色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，干燥后封片。將樹(shù)膠片置于鏡下觀察，分別取4個(gè)不同視野，每個(gè)視野均包含至少200個(gè)細(xì)胞，取平均值。按如下標(biāo)準(zhǔn)計(jì)分：數(shù)量占比計(jì)分：<5%計(jì)0分，5%～25%計(jì)1分，>25%～50%計(jì)2分，>50%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分；染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)色計(jì)0分，淺著色(淺黃)計(jì)1分，著色適中(黃棕色)計(jì)2分，深著色(棕褐色)計(jì)3分。數(shù)量占比與染色強(qiáng)度相乘：<3為陰性，≥3為陽(yáng)性。

1.3 隨訪 初步篩選出符合條件的病例之后，剔除之前接受其他抗腫瘤手段治療的、合并其他種類癌癥的、年齡超過(guò)75周歲的病例。以患者出院為觀察起點(diǎn)，對(duì)患者采用電話、電子通訊等手段隨訪，隨訪時(shí)間截止于2016年10月，隨訪時(shí)長(zhǎng)9～73(48.58±16.35)個(gè)月，失訪6例，隨訪率92.31%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。CD44v6、LYVE-1表達(dá)的組間比較采用χ2檢驗(yàn)、Fisher′s確切概率法，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)。預(yù)后分析采用Kaplan-Meier生存曲線法，組間比較采用Log-Rank法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同宮頸組織CD44v6、LYVE-1的表達(dá)比較 正常宮頸組織、宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變組織、宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織CD44v6陽(yáng)性表達(dá)率分別為9.38%(3/32)、44.68%(21/47)、70.51%(55/78)；LYVE-1陽(yáng)性表達(dá)率分別為15.63%(5/32)、55.32%(26/47)、78.21%(61/78)。正常宮頸組織中CD44v6和LYVE-1陽(yáng)性表達(dá)率均低于宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變組織(χ2分別為11.220、12.581，P分別為0.001、0.000)及宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織(χ2分別為34.027、37.027，P分別為0.000、0.000)。宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變組織CD44v6、LYVE-1陽(yáng)性表達(dá)率低于宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織(χ2分別為8.211、7.260，P分別為0.004、0.007)。

2.2 宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中CD44v6、LYVE-1的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中CD44v6的表達(dá)與FIGO分期、組織學(xué)分化程度、肌層浸潤(rùn)深度、淋巴管浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P均<0.05)，與患者年齡、腫瘤直徑無(wú)關(guān)(P均>0.05)；而LYVE-1的表達(dá)則與組織學(xué)分化程度、肌層浸潤(rùn)深度、淋巴管浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān)(P均<0.05)，與患者年齡、FIGO分期、腫瘤直徑無(wú)關(guān)(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中CD44v6、LYVE-1表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系(例)

2.3 宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織CD44v6與LYVE-1表達(dá)之間的關(guān)系 Spearman秩相關(guān)結(jié)果顯示，宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織CD44v6與LYVE-1表達(dá)正相關(guān)(rs=0.408，P=0.000)。

2.4 CD44v6、LYVE-1在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 至隨訪截止日，CD44v6陽(yáng)性患者生存率58.18%(32/55)，生存時(shí)間(53.72±3.19)個(gè)月；CD44v6陰性患者生存率78.26%(18/23)、生存時(shí)間(67.61±2.18)個(gè)月；CD44v6陽(yáng)性患者均低于陰性患者(χ2=4.095，P=0.043；t=19.068，P=0.000)。LYVE-1陽(yáng)性患者生存率57.37%(35/61)、生存時(shí)間(54.44±2.93)個(gè)月，LYVE-1陰性患者生存率88.24%(15/17)、生存時(shí)間(69.81±2.24)個(gè)月，LYVE-1陽(yáng)性患者均低于陰性患者(χ2=5.698，P=0.017；t=20.036，P=0.000),見(jiàn)圖1、圖2。

3 討論

因?qū)m頸癌早期無(wú)明顯癥狀，約70%的患者確診時(shí)已屬于晚期。目前主要的預(yù)防手段為普及防癌知識(shí)、重視高危人群、提醒身體異常者及時(shí)就醫(yī)。據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)估算，若對(duì)宮頸癌高發(fā)年齡段(35～64周歲)的女性每3～5年進(jìn)行一次高質(zhì)量的細(xì)胞學(xué)篩查，將使參與檢查的女性宮頸癌致死率降低至少80%。因此尋找早期診斷的無(wú)創(chuàng)、可靠手段能夠有效改善宮頸癌患者預(yù)后，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。

圖1 CD44v6表達(dá)陽(yáng)性與陰性患者的術(shù)后生存曲線

圖2 LYVE-1表達(dá)陽(yáng)性與陰性患者的術(shù)后生存曲線

腫瘤細(xì)胞侵襲力、轉(zhuǎn)移力與細(xì)胞的黏附力密切相關(guān)。細(xì)胞黏附力的改變因素之一是細(xì)胞黏附因子的異常表達(dá)或功能改變?？缒ぬ堑鞍證D44結(jié)構(gòu)中包含細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和7個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，參與了細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-基質(zhì)的相互作用。CD44有許多種變異體亞型，目前根據(jù)已經(jīng)測(cè)得的至少10種選擇性剪接的外顯子以v1～v10區(qū)分。其中，CD44v6這一變異體是目前研究的熱點(diǎn)。Zhao等[6]通過(guò)對(duì)187例結(jié)直腸癌的患者研究發(fā)現(xiàn)，在預(yù)測(cè)Ⅱ～Ⅲ期結(jié)直腸癌患者預(yù)后方面，CD44v6比CD44更為精確、有效。這可能因?yàn)檫^(guò)表達(dá)的CD44v6顯著地增強(qiáng)了結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。許多研究表明，CD44v6表達(dá)增強(qiáng)，意味著胃癌、胰腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液性腫瘤、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞侵襲力增強(qiáng)。

本研究檢測(cè)了不同宮頸組織中CD44v6的表達(dá)情況，結(jié)果表明CD44v6在正常宮頸組織、宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變宮頸組織、宮頸鱗狀細(xì)胞癌宮頸組織中的表達(dá)依次遞增，表明CD44v6的表達(dá)增強(qiáng)，同樣能夠提高宮頸鱗狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道研究結(jié)果近似。本研究還發(fā)現(xiàn)，CD44v6的表達(dá)與FIGO分期、組織學(xué)分化程度、肌層浸潤(rùn)深度、淋巴管浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征相關(guān)，表明CD44v6可能參與了宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。淋巴管轉(zhuǎn)移是宮頸癌癌細(xì)胞播散的重要途徑之一。近年發(fā)現(xiàn)了許多新的主要定位于淋巴管的腫瘤標(biāo)記物，如LYVE-1、Prox-1、Podoplanin、D2-40等。LYVE-1是Banerji等[7]在尋找CD44相似或相關(guān)的透明質(zhì)酸受體時(shí)發(fā)現(xiàn)的，與CD44的同源氨基酸序列高達(dá)41%，是一種主要表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上的膜蛋白。Bai等[8]利用活體內(nèi)冷凍技術(shù)冷凍了活體小鼠體內(nèi)的腸系膜淋巴結(jié)，發(fā)現(xiàn)LYVE-1均勻分布于淋巴管的管腔、基底，但并不在被膠原細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞包圍的外層內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。因此LYVE-1可以被用作特異性淋巴管內(nèi)皮標(biāo)志物。Yu等[9]發(fā)現(xiàn)，LYVE-1與S1P3共同作用于低相對(duì)分子質(zhì)量透明質(zhì)酸調(diào)控的淋巴管新生，而淋巴管新生是多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要步驟。此外，LYVE-1基因被敲除的小鼠體內(nèi)淋巴管構(gòu)造和功能均出現(xiàn)明顯異常，提示LYVE-1還可能參與調(diào)控淋巴管的通透性，從而調(diào)控腫瘤的淋巴管侵襲力、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力。

本研究發(fā)現(xiàn)，LYVE-1在正常宮頸組織、宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變宮頸組織、宮頸鱗狀細(xì)胞癌宮頸組織中的表達(dá)同樣依次遞增，且其表達(dá)與組織學(xué)分化程度、肌層浸潤(rùn)深度、淋巴管浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征相關(guān)，與患者年齡、FIGO分期、腫瘤直徑無(wú)關(guān)。這表明LYVE-1表達(dá)的上調(diào)，意味著宮頸癌細(xì)胞侵襲能力和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，與文獻(xiàn)報(bào)道實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)的分析結(jié)果顯示，CD44v6與LYVE-1的表達(dá)呈正相關(guān)，而兩者均與腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，由此推測(cè)，CD44v6與LYVE-1能夠通過(guò)相互作用，共同增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。經(jīng)過(guò)隨訪調(diào)查，CD44v6與LYVE-1表達(dá)陽(yáng)性的患者生存率、生存時(shí)間均較陰性患者低，與之前的免疫組化、相關(guān)性檢驗(yàn)的結(jié)果相印證。進(jìn)一步提示應(yīng)當(dāng)對(duì)CD44v6與LYVE-1表達(dá)陽(yáng)性的患者密切監(jiān)測(cè)，個(gè)體化治療，以改善預(yù)后。

綜上所述，CD44v6、LYVE-1在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中過(guò)量表達(dá)，均與患者不良預(yù)后相關(guān)，CD44v6、LYVE-1可能參與并促進(jìn)了宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生以及惡性進(jìn)展過(guò)程。聯(lián)合檢測(cè)CD44v6與LYVE-1將可能為宮頸鱗狀細(xì)胞癌診療方案的制定提供重要參考。