胸腔積液中巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子的表達(dá)

王瑩，楊軍平，楊小軍，肖亮，梁華

(江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006)

檢測(cè)胸腔積液的方法多種多樣，但各有局限性，例如臨床比較常用、最簡(jiǎn)單、最特異的方法—胸水脫落細(xì)胞學(xué)檢查，陽(yáng)性率比較低，只有約為30%[1－3]。這是由于在細(xì)胞學(xué)診斷中經(jīng)常會(huì)遇到不典型的細(xì)胞形態(tài)，難以鑒別其來(lái)源及性質(zhì)。而目前有很多的學(xué)者采用生物學(xué)免疫標(biāo)記物檢測(cè)方法來(lái)彌補(bǔ)細(xì)胞學(xué)診斷中的盲區(qū)，提高判斷胸腔積液性質(zhì)的準(zhǔn)確性。本研究中我們采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)IL－6、TNF－α、IL－13、TGF－β1 及 RT－PCR 技術(shù)檢測(cè) IL－6、TNF－α、Arg－1 mRNA 相結(jié)合的方法研究巨噬細(xì)胞因子在不同性質(zhì)胸腔積液細(xì)胞中的表達(dá)差異，同時(shí)結(jié)合臨床病史資料，進(jìn)一步探討其臨床診療價(jià)值。

1 資料和方法

1．1 一般資料 所有患者均為2016年5月至2017年12月期間在我院呼吸科住院治療的70例胸腔積液患者，其中良性胸腔積液患者39例，男性26例，女性13例，平均年齡52歲，均經(jīng)過(guò)胸水脫落細(xì)胞學(xué)檢查、PPD試驗(yàn)、痰找抗酸桿菌、細(xì)菌培養(yǎng)或臨床診斷性治療等方法明確診斷。39例中膿胸伴胸腔積液21例，低蛋白血癥伴胸腔積液7例，心功能衰竭伴胸腔積液5例，肺炎旁性胸腔積液3例，胰腺炎2例，寄生蟲感染1例。另外惡性胸腔積液患者31例，男性21例，女性10例，平均年齡56歲，均經(jīng)胸部CT檢查、胸水脫落細(xì)胞學(xué)檢查、支氣管鏡檢查和活檢、淋巴結(jié)活檢、胸膜活檢或腫塊穿刺等方法診斷為惡性胸腔積液。其中肺癌25例，乳腺癌伴胸膜轉(zhuǎn)移和食道癌伴胸膜轉(zhuǎn)移各2例，惡性胸膜間皮瘤1例，惡性淋巴瘤1例。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組患者性別、年齡比較無(wú)顯著性差異 （P＞0．05）。標(biāo)本處理步驟：取新鮮胸腔積液200ml加入 3．8%肝素抗凝管中，以 2500r/min，離心15min，收集沉淀后置于－80℃冰箱內(nèi)保存；取新鮮胸腔積液20ml，進(jìn)行積液常規(guī)檢測(cè)、積液生化分析及積液CEA檢測(cè)，同時(shí)患者采血檢測(cè)血清CEA。

1．2 方法

1．2．1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè) 取胸腔積液患者血液，立即分離血清，進(jìn)行IL－6、TNF－α、IL－13、TGF－β1 細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)。IL－6、TNF－α、IL－13、TGF－β1 酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于深圳晶美生物工程有限公司，全部操作嚴(yán)格按說(shuō)明書進(jìn)行。

1．2．2 RT－PCR 檢測(cè) IL－6、TNF－α、Arg－1 mRNA 表達(dá)水平 按照實(shí)驗(yàn)步驟，取－80℃冰箱保存的胸水沉淀細(xì)胞，用Trizol試劑提取RNA，按照試劑盒說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄cDNA。引物序列；IL－6：正向引物5'－CCACTGCCTTCCCTACTTCA －3'； 反 向 引 物 5'－ACAGTGCATCATCGCTGTTC－3'；TNF－α： 正向引物 5'－GCCAATGGCATGGATCTCAA－3'；反向引物5'－CCCTTGAAGAGAACCTGGGA－3'；Arg－1： 正向引物 5'－ACCCTGACCTATGCGTCATT－3'；反向引物 5'－ATTCCCAGAGCTGGTTGTCA －3'；GAPDH：正向引物 5'－GCTACACTGAGGACCAGGTT－3'；反向引物 5'－CCCAGCATCAAAGGTGGAAG－3'。 PCR反應(yīng)條件循環(huán)擴(kuò)增，測(cè)定相對(duì)含量。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果輸入SAS 9．0統(tǒng)計(jì)軟件分析，表達(dá)水平比較采用t檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有顯著性。相關(guān)分析用直線相關(guān)分析法（先對(duì)數(shù)據(jù)作對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后作Pearson相關(guān)性分析）。

2 結(jié)果

2．1 不同性質(zhì)胸腔積液患者血清 IL－6、TNF－α、IL－13、TGF－β1表達(dá)水平 見(jiàn)表 1。

2．2 不同性質(zhì)胸腔積液中 IL－6、TNF－α、Arg－1 mRNA表達(dá)水平 見(jiàn)表2。

2．3 積 液 CEA 與 胸 腔 積 液 TNF－α、IL－6、Arg－1mRNA及血清CEA相關(guān)性分析 胸腔積液TNF－α、IL－6、Arg－1mRNA 的表達(dá)與血清癌胚抗原、胸腔積液癌胚抗原的表達(dá)呈現(xiàn)不同的正相關(guān)性 (r=0．399，P＜0．05；r=0．498，P＜0．01；r=0．547，P＜0．01)。見(jiàn)表3。

表 1 各組 IL-6、TNF-α、IL-13、TGF-β1 表達(dá)水平（±s）

表 1 各組 IL-6、TNF-α、IL-13、TGF-β1 表達(dá)水平（±s）

注：與良性積液組比較，#P＜0．01，*P＜0．05。

組別 n良性積液組惡性積液組t 39 31 IL－6 TNF－α IL－13 TGF－β1 26．98±2．76 87．09±10．47#45．88 30．09±3．01 95．09±46．97#11．46 28．56±3．12 17．96±2．18*－23．04 37．52±10．70 220．52±30．41#46．16

表 2 各組 IL-6、TNF-α、Arg-1 mRNA表達(dá)量（±s）

表 2 各組 IL-6、TNF-α、Arg-1 mRNA表達(dá)量（±s）

注：與良性積液組比較，#P＜0．01。

65．18±89．2 135．66±199．7#組別良性積液組惡性積液組n IL－6 39 31 31．89±12．11 155．4±86．4#TNF－α Arg－1mRNA 49．57±12．61 81．3±43．2#

表3 積液CEA與胸腔積液TNF-α、IL-6、Arg-1mRNA及血清CEA相關(guān)性分析

3 討論

引起胸膜腔積液的原因很多，但是從細(xì)胞免疫的角度來(lái)說(shuō)，是因?yàn)榧せ畹拿庖呒?xì)胞聚集在病變部位，這些免疫細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，有效地發(fā)揮局部細(xì)胞免疫作用。IL－6是單核巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞產(chǎn)生的促炎因子，IL－13是活化T細(xì)胞產(chǎn)生的抗炎因子，TNF－α是活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的前炎癥因子，TGF－β1具有雙面效應(yīng)，正常表達(dá)時(shí)抑制炎癥反應(yīng)，過(guò)度表達(dá)時(shí)發(fā)生炎癥性病理變化，綜上所知，這些細(xì)胞因子都是參與炎癥反應(yīng)的[4－6]。本研究結(jié)果表明：惡性胸腔積液中患者血清IL－6、TGF－β1、TNF－α含量均升高，說(shuō)明胸腔局部合成的 IL－6、TNF－α、TGF－β1 增多，是導(dǎo)致胸膜組織病理學(xué)改變、引起胸腔積液滲出的主要原因之一。IL－6是基質(zhì)細(xì)胞和免疫系統(tǒng)細(xì)胞產(chǎn)生的多效細(xì)胞因子，其在機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)與機(jī)體防御中起到重要的作用。IL－6是公認(rèn)的促炎細(xì)胞因子，體液中IL－6的水平反映了局部炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度。惡性胸腔積液中IL－6含量增加的原因可能是由于癌細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，通過(guò)自分泌環(huán)路或旁分泌環(huán)路調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的免疫活性，導(dǎo)致局部強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，從而誘導(dǎo)IL－6的形成與產(chǎn)生。TNF－α是重要的炎性介質(zhì)，由活化的巨噬細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的雙效炎癥因子，TNF－α通過(guò)損傷內(nèi)皮細(xì)胞，使血管損傷，導(dǎo)致癌癥組織的局部血流受阻斷而引起出血、缺氧壞死現(xiàn)象。TGF－β1是具有多種功能的蛋白小分子多肽，是TGF－β家族的一員。它在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、免疫調(diào)節(jié)、炎癥、胚胎發(fā)育和組織修復(fù)等方面發(fā)揮重要的作用，TGF－β1在腫瘤細(xì)胞中可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，通過(guò)調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞，產(chǎn)生胞外基質(zhì)蛋白和細(xì)胞粘附蛋白，降低胞外基質(zhì)的降解酶的生成，增加抑制降解酶的蛋白生成，從而調(diào)節(jié)胞外基質(zhì)的粘附性，并通過(guò)增加蛋白水解酶活性啟動(dòng)與細(xì)胞粘附分子的結(jié)合，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。TGF－β1表達(dá)增高見(jiàn)于腫瘤性疾病如宮頸癌、肝癌，有研究證實(shí)在肺癌組織和血清中 TGF－β1 存在高表達(dá)[7－9]。 TGF－β1對(duì)腫瘤的直接影響一般是通過(guò)Smads依賴途徑或者干擾Smads依賴途徑的介導(dǎo)來(lái)完成[10]，且其高表達(dá)與預(yù)后密切相關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)胞因子在釋放入血的同時(shí)，貯存在腫瘤組織的周圍及因腫瘤導(dǎo)致的胸腹水中，惡性腫瘤也在胸膜轉(zhuǎn)移，胸膜通透性增加。TGF－β1釋放入胸腔積液中。本文顯示，在惡性胸膜炎中TGF－β1的表達(dá)升高，惡性胸腔積液TGF－β1含量與良性積液組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），原因可能在炎癥反應(yīng)初期，TGF－β1招募和激活損傷部位的各種細(xì)胞，促使TGF－β1在局部不斷增加。有報(bào)道，支氣管灌洗液中TGF－β1高表達(dá)的原因，與癌癥病變的分期密切相關(guān)[11]，文獻(xiàn)報(bào)道[12]惡性積液中的TGF－β1表達(dá)明顯高于膿胸和漏出液，我們的結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致。精氨酸酶(arginase，Arg)是一種參與尿酸循環(huán)的酶，有研究發(fā)現(xiàn)Arg－1在肝組織內(nèi)高表達(dá)，在胸腔組織中也表達(dá)[13]。近年來(lái)有研究報(bào)道Arg－1是一種非常敏感的胸腔細(xì)胞腫瘤標(biāo)記物，但報(bào)道結(jié)果差異性大。Fujiwara 和 McKnight[14，15]等研究發(fā)現(xiàn) Arg－1陽(yáng)性率分別為81%和84．4%，略低于我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可能與我們所采用的方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)不一樣有關(guān)。我們研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Arg－1在惡性胸腔積液中的表達(dá)明顯高于良性胸腔積液，結(jié)果提示Arg－1是一種比較敏感的判斷胸腔積液細(xì)胞性質(zhì)來(lái)源的標(biāo)記物。