豬ITGB1與miR-181a靶向關(guān)系的驗(yàn)證

邱梅玉，黃 濤，胡廣東，李 濤，孫敬禮

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832000）

miRNAs是長(zhǎng)度約19～24 nt，進(jìn)化上保守的內(nèi)源性非編碼的RNA，可與靶基因的3'UTR特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制mRNA翻譯或降解mRNA來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)[1]。研究表明，miRNAs對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育具有調(diào)節(jié)作用，還可通過(guò)不同的表達(dá)模式調(diào)節(jié)許多生理過(guò)程[2]。

整合素β1（Integrinβ1，ITGB1）是廣泛表達(dá)的細(xì)胞表面受體家族之一，其介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)黏附為胚胎著床期間重要的黏附分子[3]，它與滋養(yǎng)層細(xì)胞侵潤(rùn)子宮內(nèi)膜和子宮容受性改變密切相關(guān)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，在介導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞黏附以及遷移的整合素中，ITGB1具有非常重要的作用[5]；特別是在分泌期子宮內(nèi)膜中ITGB1表達(dá)水平降低，可能會(huì)影響子宮內(nèi)膜對(duì)胚泡的識(shí)別、黏附，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性的降低，使著床失敗引起不孕[6]。

目前，miRNAs在動(dòng)物妊娠及胚胎附植過(guò)程中的研究也已展開(kāi)，其通過(guò)動(dòng)物組織及體液參與調(diào)控細(xì)胞增殖、胚胎發(fā)育及器官發(fā)育等重要的生理學(xué)過(guò)程[7]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，miR-181a和miR-181c通過(guò)調(diào)節(jié)分泌型磷酸蛋白1（SPP1）、整合素β3（ITGB3）和雌激素受體（ESR1）基因參與細(xì)胞增殖和胚胎附植等過(guò)程[8]。Liu等[9]研究發(fā)現(xiàn)，miR-181a可以通過(guò)特異性靶向其mRNA 3'UTR抑制海馬神經(jīng)元的發(fā)育來(lái)抑制轉(zhuǎn)錄因子cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB1）的表達(dá)；同時(shí)在體內(nèi)和體外miR-181a的抑制性表達(dá)參與胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）介導(dǎo)的CREB1上調(diào)，這些發(fā)現(xiàn)表明miR-181a可能是預(yù)防神經(jīng)退行性疾病的潛在靶標(biāo)。但對(duì)于豬miR-181a與靶基因的研究報(bào)道較少。本研究利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)豬miR-181a的靶基因ITGB1，并成功構(gòu)建豬ITGB1基因3'UTR雙熒光素酶載體，利用雙熒光素酶驗(yàn)證、qRT-PCR和Western blot進(jìn)一步驗(yàn)證miR-181a和ITGB1基因的靶向關(guān)系，為揭示miR-181a調(diào)節(jié)豬妊娠過(guò)程的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 主要儀器：細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)Thermo公司；核酸蛋白檢測(cè)儀、CyclerTMThermal Cycler PCR儀、水平電泳槽電泳儀和Vniversal HoodⅡ凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；Multiskan?GO 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司。

主要試劑：miR-RiboTMmiRNA mimics、miR-RiboTMmiRNA mimics Negative Control、miR-RiboTMmiRNA inhibitor和miR-RiboTMmiRNA inhibitor Negative Control購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；BCA蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海生物工程技術(shù)有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；DMEM/Opti-MEN培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；澳洲特級(jí)胎牛血清購(gòu)自澳洲AusGeneX公司；含EDTA的胰蛋白酶、高效RIPA裂解液（組織/細(xì)胞）購(gòu)自北京索萊寶公司；ITGB1、β-actin一抗和二抗購(gòu)自美國(guó)CST；限制性內(nèi)切酶（XhoⅠ 、NotⅠ）、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和T4-DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa大連寶生物有限公司；普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和無(wú)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購(gòu)自北京天根生化有限公司；PK-15細(xì)胞由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)趙志超博士惠贈(zèng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 miRNA的靶基因預(yù)測(cè) 利用miRanda（http://miranda.org.uk/）、RNAhybrid（http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid）、targetscan（http：//www.targetscan.org）靶基因預(yù)測(cè)軟件，對(duì)miR-181a的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，并分析miR-181a與豬ITGB1基因的結(jié)合位點(diǎn)。

1.2.2 雙熒光素酶基因報(bào)告質(zhì)粒及突變體的構(gòu)建 根據(jù)預(yù)測(cè)的3'-UTR結(jié)合位點(diǎn)，設(shè)計(jì)野生型載體和突變型載體引物（表1）。對(duì)候選靶基因3'-UTR區(qū)序列進(jìn)行擴(kuò)增。構(gòu)建了包含ITGB1-3'-UTR的雙熒光酶報(bào)告載體psiCHECKTM-2-W-ITGB1-3'-UTR（野生型）和psiCHECKTM-2-M-ITGB1-3'-UTR（突變型）。

1.2.3 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 將PK-15細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，待細(xì)胞貼壁達(dá)到70%～80%時(shí)即可轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)，分為psiCECK-2-W-ITGB1-3'-UTR+miR-181a mimic、psiCHECK-2-WITGB1-3'-UTR+miR-181a mimic NC、psiCHECK-2-MITGB1-3'-UTR+miR-181a mimic和psiCHECK-2-MITGB1-3'-UTR+miR-181a mimic NC 4個(gè)處理組，每組設(shè)3個(gè)平行孔，轉(zhuǎn)染24 h后收細(xì)胞、裂解、離心，取上清，用Dual-Luciferase?Reporter Assay System檢測(cè)雙熒光素酶活性。

1.2.4 熒光定量PCR 將PK-15細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好且細(xì)胞貼壁達(dá)到70%～80%時(shí)轉(zhuǎn)染，分為 miR-181a mimic、miR-181a mimic NC、miR-181a inhibitor 和miR-181a inhibitor NC進(jìn)行。轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞RNA的提取。反轉(zhuǎn)錄參照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)。熒光定量PCR反應(yīng)體系：ddH2O 7 μL，SYBR 10 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，cDNA 1 μL ，共 20 μL。反應(yīng)條件：94 變性 5 min，35次循環(huán)（94 ，30 s；60 ，30 s；72 ，30 s；72 ，5 min）。

1.2.5 Western blot 檢測(cè) 將蛋白裂解液加入到PK15細(xì)胞中，冰上孵育30 min 后，離心提取蛋白上清，經(jīng)BCA法檢測(cè)蛋白濃度。將蛋白樣品等量（約30 μg）加樣按照常規(guī)步驟進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)膜，封閉，抗體孵育和發(fā)光檢測(cè)。一抗稀釋濃度分別為ITGB1（1:1 000）和β-actin（1:3 000），二抗稀釋濃度Anti-rabbit IgG（1:15 000），通過(guò)Odyssey CLX 近紅外雙色熒光成像系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)光值。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 分析雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)中1、2、3和4組的螢火蟲(chóng)值和海腎值的數(shù)據(jù)，并計(jì)算二者之比，利用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，樣本間差異顯著性檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-181a的靶基因預(yù)測(cè) 利用miRanda、RNA hybrid和targetscan進(jìn)行miR-181a靶基因預(yù)測(cè)，結(jié)果表明ITGB1基因mRNA的3'-UTR與miR-181a具有結(jié)合位點(diǎn)，說(shuō)明ITGB1可能是miR-181a的靶基因（圖1）。

表1 候選靶基因擴(kuò)增引物信息

圖1 ITGB1基因3'-UTR與miR-181a結(jié)合位點(diǎn)

2.2ITGB1基因3'-UTR雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建將提取的空載體psiCHECK-2質(zhì)粒、野生型ITGB13'-UTR重組質(zhì)粒和突變型ITGB13'-UTR重組質(zhì)粒分別用NotⅠ 及 XhoⅠ 進(jìn)行雙酶切后，得到含粘性末端的目的基因片段和空載體片段，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、膠回收純化。將純化好的野生型ITGB13'-UTR片段（393 bp）和突變型ITGB13'-UTR片段（393 bp）分別與psiCHECK-2空載體進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，得到野生型（psiCHECK2-ITGB1-W-3'UTR）及突變型（psiCHECK2-ITGB1-M- 3'UTR）雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。通過(guò)回收連接產(chǎn)物送上海生工測(cè)序，測(cè)序拼接結(jié)果與目的片段大小一致。通過(guò)Blast 比對(duì)，突變型只改變?nèi)藶楦淖兊膸讉€(gè)堿基。進(jìn)一步將重組質(zhì)粒經(jīng)NotⅠ 及XhoⅠ雙酶切后進(jìn)行電泳表明ITGB1基因3'-UTR雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖2）。

圖2 ITGB1基因3'-UTR psiCHECKTM-2 Vector載體雙酶切圖

2.3 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)熒光值表達(dá) 將miR-181a mimic或其陰性對(duì)照與psiCHECKTM-2-W-ITGB1-3'-UTR 重組質(zhì)?；騪siCHECKTM-2-M -ITGB1-3'-UTR重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)PK-15細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染野生型熒光素酶載體的細(xì)胞中，共轉(zhuǎn)染miR-181a mimic組熒光素酶活性相對(duì)陰性對(duì)照極顯著下調(diào)50%（P＜0.01）。而在轉(zhuǎn)染突變型熒光素酶載體的細(xì)胞中，組間差異不顯著（P＞0.05）(圖 3)。

圖3 雙熒光素酶檢測(cè)

2.4 miR-181a過(guò)表達(dá)/抑制對(duì)PK-15細(xì)胞中ITGB1mRNA表達(dá)的影響 miR-181a mimic轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞24 h后，采用qRT-PCR方法分別檢測(cè)陰性對(duì)照組和miR-181a mimic組中靶基因的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miR-181a mimic組的ITGB1mRNA表達(dá)量顯著低于其陰性對(duì)照組（P＜0.01），miR-181a inhibitor組ITGB1mRNA 表達(dá)量較其陰性對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）（圖4）。

圖4 miR-181a對(duì)PK15細(xì)胞中ITGB1mRNA表達(dá)的影響

2.5 miR-181a過(guò)表達(dá)/抑制對(duì)PK-15細(xì)胞中ITGB1蛋白表達(dá)的影響 miR-181a mimic轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞24 h后，采用Western blot方法分別檢測(cè)陰性對(duì)照組和miR-181a mimic組中miR-181a mimic及其靶基因的蛋白表達(dá)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miR-181a mimic的ITGB1蛋白表達(dá)量顯著低于其陰性對(duì)照組（P＜0.05），miR-181a inhibitor組ITGB1蛋白量與其陰性對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）（圖5）。

圖5 不同處理組細(xì)胞中ITGB1蛋白的表達(dá)

3 討 論

miRNAs主要通過(guò)與靶基因的3′UTR結(jié)合，使靶基因的表達(dá)量下調(diào)。在人、小鼠和雞上，miR-181a調(diào)節(jié)的靶基因眾多，包括ERα[10]、TNF-α[11]、BCL-2[12]、FasL[13]、BTBD3、KIF3B、ANP32A和CNOT2[14]， 但在豬妊娠過(guò)程中miR-181a與靶基因研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用生物信息學(xué)軟件miRanda、RNAhybrid和targetscan對(duì)miR-181a的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)了與胚胎著床相關(guān)的基因ITGB1，并進(jìn)一步驗(yàn)證miR-181a與靶基因ITGB1的靶向關(guān)系。

整合素成員家族是在質(zhì)膜上跨膜運(yùn)輸?shù)奶堑鞍撞⒂煞枪矁r(jià)構(gòu)成α和β亞基，每個(gè)亞基由細(xì)胞外域、細(xì)胞內(nèi)域和跨膜區(qū)域組成。整聯(lián)蛋白成員在信號(hào)傳導(dǎo)胎盤(pán)細(xì)胞滋養(yǎng)層發(fā)育進(jìn)展為侵襲性表型中起關(guān)鍵作用[15]。ITGB1是整合素家族成員之一，由于不能黏附或侵入上皮下基質(zhì)，ITGB1在月經(jīng)周期中組成型表達(dá)，并且小鼠囊胚期缺乏ITGB1亞基則不能附植[16]。孫桂榮等[17]發(fā)現(xiàn)，miR-181a表達(dá)有時(shí)序和組織差異性。Krawczynsk等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b可調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育和豬子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞的附植。另有研究表明，miR-101a受環(huán)氧化酶-2基因的調(diào)節(jié)，對(duì)胚胎植入至關(guān)重要[19]。Liu等[20]對(duì)孕早期胚胎植入過(guò)程中小鼠的子宮內(nèi)膜miRNA表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)的miR-141會(huì)降低基質(zhì)細(xì)胞的增殖能力及促進(jìn)凋亡，并且會(huì)影響小鼠胚胎植入的位置，因此推測(cè)miR-141在胚胎植入過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

本研究預(yù)測(cè)并通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-181a與豬ITGB13′UTR區(qū)靶向結(jié)合，qRT-PCR和Western blot結(jié)果表明miR-181a顯著下調(diào)PK15細(xì)胞中ITGB1的mRNA和蛋白表達(dá)，但mRNA表達(dá)水平達(dá)到極顯著而蛋白水平達(dá)到顯著，可能是蛋白降解或修飾折疊導(dǎo)致mRNA豐度與蛋白表達(dá)水平不一致。另外，有研究發(fā)現(xiàn)miR-181a在牛胚泡中表達(dá)下調(diào)[21]。由此推測(cè)，在豬中也可能存在miR-181a通過(guò)妊娠期表達(dá)下調(diào)負(fù)調(diào)節(jié)其靶基因ITGB1從而促進(jìn)胚胎附植，這將為進(jìn)一步研究miR-181a調(diào)節(jié)胚胎著床的作用其機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。