肝胃百合湯對(duì)慢性應(yīng)激與幽門螺桿菌雙重?fù)p傷因素模型小鼠胃黏膜組織TFF1、p-ERK蛋白表達(dá)的影響

喻斌 曾孟暉 徐寅 陽(yáng)力 周賽男 杜珊 毛一之 李珍 李玲

摘要：目的 ?觀察肝胃百合湯對(duì)慢性應(yīng)激與幽門螺桿菌（Hp）雙重?fù)p傷因素模型小鼠胃黏膜組織三葉因子1（TFF1）、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（p-ERK）蛋白表達(dá)的影響，探討其治療慢性應(yīng)激性胃潰瘍合并Hp感染的相關(guān)機(jī)制。方法 ?將60只BALB/c雄性小鼠隨機(jī)分為空白組、應(yīng)激組、單純Hp組、雙重因素組、肝胃百合湯組、雷尼替丁組，每組10只，選取10種不可預(yù)知刺激因素制備慢性應(yīng)激小鼠模型，造模第7日給予單純Hp組、雙重因素組、肝胃百合湯組、雷尼替丁組灌胃Hp菌液;肝胃百合湯組給予肝胃百合湯灌胃，雷尼替丁組給予雷尼替丁灌胃，其余各組給予蒸餾水灌胃。采用免疫組化檢測(cè)小鼠胃黏膜組織TFF1、p-ERK蛋白表達(dá)。結(jié)果??雙重因素組潰瘍指數(shù)與TFF1、p-ERK蛋白表達(dá)明顯高于空白組（P<0.01）;與雙重因素組比較，肝胃百合湯組和雷尼替丁組潰瘍指數(shù)顯著降低（P<0.01），且肝胃百合湯組明顯低于雷尼替丁組（P<0.01）;肝胃百合湯組和雷尼替丁組TFF1、p-ERK蛋白表達(dá)明顯高于雙重因素組（P<0.05，P<0.01），且肝胃百合湯組明顯高于雷尼替丁組（P<0.01）。結(jié)論??慢性應(yīng)激與Hp可協(xié)同致胃黏膜損傷，肝胃百合湯可促進(jìn)TFF1、p-ERK的表達(dá)及胃黏膜的修復(fù)，達(dá)到促進(jìn)潰瘍愈合的目的。

關(guān)鍵詞：肝胃百合湯;慢性應(yīng)激性胃潰瘍;幽門螺桿菌;三葉因子1;磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶;小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.10.011

中圖分類號(hào)：R285.5 ???文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ???文章編號(hào)：1005-5304（2018）10-0044-05

Effects?of Ganwei Baihe?Decoction on Protein Expressions?of TFF1 and p-ERK in Gastric?Mucosa of Model Mice with Chronic Stress and Helicobacter Pylori Double Injury Factors

YU Bin¹，?ZENG Meng-hui²，?XU Yin¹，?YANG Li¹，?ZHOU Sai-nan¹，?DU Shan²，?MAO Yi-zhi²，?LI Zhen¹，?LI Ling¹

1. First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，?Changsha 410007，?China;

2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China

Abstract：?Objective?To observe the effects?of Ganwei Baihe?Decoction on the protein expressions?of TFF1 and p-ERK in gastric mucosa of model mice with chronic stress and Helicobacter pylori （Hp） double injury factors; To explore the relevant mechanism for?treating?chronic stress gastric ulcer complicated with Hp?infection.?Methods?Totally sixty BALB/c male mice were randomly divided into blank group， stress group， Hp group， double factors group， Ganwei Baihe?Decoction group， and ranitidine group， with 10 mice in each group. 10 unpredictable stimulus factors were selected to prepare chronic stress mouse models. On the 7^th?day of modeling， Hp group， double factors group， Ganwei Baihe?Decoction group，?and ranitidine group?were given Hp bacteria， Ganwei Baihe?Decoction?and ranitidine?were given to corresponding groups?for gavage， respectively， and the other groups were given distilled water for gavage.?The protein expressions?of TFF1 and p-ERK in gastric mucosa of mice were detected by immunohistochemistry.?Results?The ulcer index and protein expressions of TFF1 and p-ERK in the double factors?group were higher than those of the blank group?（P<0.05， P<0.01）;?Compared with double factors group， the gastric mucosal injury index decreased in Ganwei Baihe?Decoction group and ranitidine group?（P<0.01）， and Ganwei Baihe?Decoction group was lower than ranitidine group?（P<0.01）;?The?protein expressions of?TFF1 and p-ERK in Ganwei Baihe?Decoction group and ranitidine group were significantly higher than those in double factors group?（P<0.01），and?Ganwei Baihe?Decoction group was higher than ranitidine group?（P<0.01）.?Conclusion?Chronic stress and Hp can cause gastric mucosal injury in synergy;?Ganwei Baihe?Decoction can promote the repair?of gastric mucosa and?expressions?of TFF1 and p-ERK， so as to?enhance ulcer healing.

Keywords： Ganwei Baihe?Decoction; chronic stress gastric ulcer; Helicobacter pylori; TFF1; p-ERK; mice

胃潰瘍是指胃黏膜在某種情況下被胃酸/胃蛋白酶自身消化而造成的潰瘍，其深度達(dá)到或超過(guò)黏膜肌層。幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）感染是消化性潰瘍的一個(gè)主要風(fēng)險(xiǎn)因素。Matsushima Y等^[1]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，日本神戶大地震后由于精神壓力過(guò)大引起的胃潰瘍患者明顯增多，而Hp對(duì)于該病的發(fā)生有著重要的影響。Yamamoto N等^[2]根據(jù)調(diào)查結(jié)果，選用小鼠對(duì)應(yīng)激與Hp協(xié)同致胃黏膜損傷的作用進(jìn)行研究，證實(shí)Hp會(huì)加劇由強(qiáng)迫小鼠游泳而引起的胃組織損傷。還有研究表明，慢性心理應(yīng)激可增加BALB/c小鼠胃內(nèi)Hp的定植量，加重Hp感染后的胃黏膜損傷^[3]，證實(shí)慢性應(yīng)激與Hp兩者可協(xié)同致胃黏膜損傷。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)于慢性應(yīng)激合并Hp感染導(dǎo)致的消化性潰瘍通常采用三聯(lián)或四聯(lián)療法根除Hp，雖見效快，但存在耐藥性高、不良反應(yīng)多、成本較高等缺點(diǎn)。肝胃百合湯是湖南省夏度衡教授創(chuàng)制，也是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院治療肝胃氣滯型胃潰瘍合并Hp感染常用驗(yàn)方。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，肝胃百合湯可改善肝胃氣滯型胃潰瘍患者的不適癥狀，修復(fù)胃黏膜損傷，并能有效根除Hp^[4-7]。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，觀察肝胃百合湯對(duì)慢性應(yīng)激與Hp雙重?fù)p傷因素模型小鼠胃黏膜組織三葉因子1（trefoil factor 1，TFF1）、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（phosphorylating extracellular signal-regulated kinases，p-ERK）蛋白表達(dá)的影響，探討其治療慢性應(yīng)激性胃潰瘍合并Hp感染的相關(guān)機(jī)制。

1 ?材料與方法

1.1 ?動(dòng)物及菌種

雄性健康BALB/c小鼠60只，SPF級(jí)，6周齡，體質(zhì)量19～22 g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SYXK（湘）2015-0003。飼養(yǎng)于溫度20～25 ℃、相對(duì)濕度50%～70%環(huán)境。幽門螺桿菌：悉尼標(biāo)準(zhǔn)菌株（Sydney strain I，SSI），其中含有空泡細(xì)胞毒素（vacA）和細(xì)胞毒素相關(guān)基因（cagA）蛋白，濃度為1×l0⁹?cfu/mL，湖南中醫(yī)藥大學(xué)微生物免疫教研室提供。

1.2 ?藥物

肝胃百合湯（百合15 g，柴胡9 g，郁金9 g，烏藥9 g，川楝子9 g，丹參9 g，白芍9 g，蒲公英15 g，甘草6 g），飲片均購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，將飲片放入涼蒸餾水中，浸泡30 min后煎煮2次，將藥汁混合后過(guò)濾，濃縮至每1 mL含原藥材1 g，離心，去掉殘?jiān)? ℃冰箱冷藏備用。鹽酸雷尼替丁膠囊，佛山手心制藥有限公司，批號(hào)1602224。

1.3 ?主要試劑與儀器

PBS（Wellbio公司），枸櫞酸鹽緩沖液（Wellbio公司），二步法試劑盒（中杉金橋公司），DAB試劑盒（中杉金橋公司），膠體金法幽門螺桿菌檢測(cè)試劑盒（艾康生物技術(shù)有限公司），p-ERK一抗（Abcam公司），TFF1一抗（Proteintech公司）。奧林巴斯攝像顯微鏡（PM 8AD），數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)（GIS-1000），Image-Pro-Plus圖像分析軟件（Media Cybernetics）。

1.4 ?分組和造模

將60只BALB/c雄性小鼠按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為空白組、應(yīng)激組、單純Hp組、雙重因素組、雷尼替丁組和肝胃百合湯組，每組10只。參照文獻(xiàn)[8-9]方法，選取10種不可預(yù)知刺激因素制備慢性應(yīng)激小鼠模型，每日上午9時(shí)更換刺激方法，連續(xù)28 d。空白組及單純Hp常規(guī)飼養(yǎng)，自由攝食。造模第7日給予單純Hp組、雙重因素組、肝胃百合湯組、雷尼替丁組灌胃Hp菌液0.5 mL/只（1×10⁹?cfu/mL），灌胃前24 h禁食、4 h禁水，灌胃后禁食禁水2 h。隔日1次，連續(xù)3次。28 d造模結(jié)束后，將小鼠斷尾取血，使用膠體金法檢測(cè)血清Hp抗體，取胃黏膜制作病理切片，電鏡觀察炎癥情況。

1.5 ?給藥

造模14 d后肝胃百合湯組小鼠給予肝胃百合湯灌胃，給藥前按人體用藥量換算成小鼠等效劑量，小鼠用藥量為12.2 g/（kg·d）。雷尼替丁組給予鹽酸雷尼替丁（參考60 kg成人每日用量），給藥前用蒸餾水溶解，按人體用藥量換算成小鼠等效劑量，小鼠用藥量為40 mg/（kg·d）。其余組分別灌服等體積蒸餾水，給藥體積均為0.4 mL/d。每日造模前1 h每組分別給予相應(yīng)藥物或蒸餾水灌胃，連續(xù)14 d。給藥2周后，全部小鼠禁食禁水12 h后處死，取出胃標(biāo)本，沿大彎側(cè)剪開胃黏膜，用冰生理鹽水將胃內(nèi)殘留物沖洗干凈。在胃黏膜損傷較明顯處取1 cm×0.5 cm黏膜組織，生理鹽水沖洗干凈，4%多聚甲醛4 ℃固定24 h，切片（厚度5 ?m），用于免疫組化檢測(cè)。

1.6 ?潰瘍指數(shù)及潰瘍抑制率測(cè)定

根據(jù)Guth標(biāo)準(zhǔn)^[10]計(jì)算潰瘍指數(shù)（UI）及潰瘍抑制率。使用微測(cè)尺按黏膜潰瘍或糜爛長(zhǎng)度：斑點(diǎn)狀糜爛計(jì)1分，糜爛長(zhǎng)度<1 mm計(jì)2分，1 mm<糜爛長(zhǎng)度≤2 mm計(jì)3分，2 mm<糜爛長(zhǎng)度≤3 mm計(jì)4分，糜爛長(zhǎng)度>3 mm計(jì)5分;糜爛寬度>1 mm時(shí)則分值加倍，全胃得分之和為UI。潰瘍抑制率（%）=（模型組潰瘍平均指數(shù)-給藥組潰瘍平均指數(shù)）÷模型組潰瘍平均指數(shù)×100%。

1.7 ?HE染色

石蠟包埋，切片，脫蠟，水洗，置于蘇木素染液中浸染2～4 min，水洗;使用1%鹽酸分化約10 s，水洗;流水沖洗5～l0 min，當(dāng)細(xì)胞核由淡紫紅色變?yōu)樗{(lán)色后，伊紅染液中浸染30 s，梯度乙醇脫水，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.8 ?胃黏膜組織三葉因子1、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶蛋白表達(dá)檢測(cè)

采用免疫組化法。石蠟切片脫蠟至水，二甲苯中浸泡2次，每次10 min，梯度乙醇（100%、95%、85%、75%）放置5 min，蒸餾水浸洗5 min;枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）微波爐加熱修復(fù)抗原，冷卻后PBS沖洗3次×3 min;3%H₂O₂浸泡10 min滅活內(nèi)源性酶。PBS沖洗3次×3 min，分別滴加p-ERK、TFF1一抗。4 ℃過(guò)夜。PBS沖洗3次×5 min;滴加二抗37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次×5 min;滴加DAB顯色劑顯色，室溫孵育1～5 min，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，蒸餾水洗滌;蘇木素復(fù)染5～10 min，蒸餾水沖洗，PBS返藍(lán);梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。使用Image-Pro-Plus圖像分析軟件對(duì)樣本圖像進(jìn)行分析。每個(gè)樣本隨機(jī)選取3個(gè)高倍視野，計(jì)算黃褐色陽(yáng)性表達(dá)的面密度（陽(yáng)性表達(dá)總面積÷統(tǒng)計(jì)區(qū)域總面積），以此表示p-ERK、TFF1蛋白的表達(dá)，進(jìn)行半定量分析。

1.9 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以x（—）±s表示，多組間比較用方差分析，符合正態(tài)分布且方差齊用LSD法，方差不齊用Tamhane's T2法，不符合正態(tài)分布用非參數(shù)檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用率或構(gòu)成比表示，采用卡方檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 ?結(jié)果

2.1 ?肝胃百合湯對(duì)模型小鼠潰瘍指數(shù)及潰瘍抑制率的影響

與空白組比較，單純Hp組、應(yīng)激組和雙重因素組UI顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）;與雙重因素組比較，肝胃百合湯組和雷尼替丁組UI顯著降低（P<0.01），且肝胃百合湯組明顯低于雷尼替丁組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;肝胃百合湯組潰瘍抑制率高于雷尼替丁組。結(jié)果見表1。

2.2 ?HE染色結(jié)果

空白組胃黏膜表面光整平滑，無(wú)明顯充血、水腫，上皮細(xì)胞及腺體排布整齊;單純Hp組胃黏膜充血腫脹，表面欠光滑平整，可見少量糜爛，腺體排布較雜亂，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn);應(yīng)激組胃黏膜上皮破損，皺襞中斷，可見細(xì)胞脫落、組織溶解，可見少量糜爛及點(diǎn)狀潰瘍，有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn);雙重因素組胃黏膜上皮明顯破損，出現(xiàn)連續(xù)性中斷，可見明顯細(xì)胞脫落、組織溶解、出血傾向，有較多糜爛、點(diǎn)狀潰瘍，可見較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，浸潤(rùn)甚至可至黏膜底層;肝胃百合湯組胃黏膜損傷較雙重因素組明顯減輕，腺體排列規(guī)整，少數(shù)有輕度充血水腫，有少量點(diǎn)狀糜爛，未見明顯潰瘍，有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);雷尼替丁組胃組織表面尚光整，有輕度水腫，腺體排布較規(guī)整，受損黏膜較表淺，可見少量糜爛，無(wú)明顯潰瘍，可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖1。

2.3 ?免疫組化染色結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示，黃褐色區(qū)域?yàn)殛?yáng)性表達(dá)。光鏡下觀察，空白組小鼠胃黏膜組織TFF1、p-ERK有少量表達(dá);單純Hp組、應(yīng)激組和雙重因素組小鼠胃黏膜組織TFF1、p-ERK表達(dá)均明顯多于空白組，且雙重因素組多于單純Hp組、應(yīng)激組;肝胃百合湯組和雷尼替丁組TFF1、p-ERK蛋白有大量的陽(yáng)性表達(dá)，明顯多于雙重因素組，且肝胃百合湯組多于雷尼替丁組。結(jié)果見圖2～圖5。

2.4 ?肝胃百合湯對(duì)模型小鼠胃黏膜組織三葉因子1、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，單純Hp組、應(yīng)激組和雙重因素組TFF1、p-ERK蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與雙重因素組比較，肝胃百合湯組和雷尼替丁組TFF1、p-ERK蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且肝胃百合湯組TFF1蛋白表達(dá)優(yōu)于雷尼替丁組，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果見表2。

3 ?討論

慢性應(yīng)激性胃潰瘍屬中醫(yī)學(xué)“胃脘痛”“胃瘍”等范疇，其發(fā)病多是因先天稟賦不足、情志不暢、飲食起居不節(jié)等導(dǎo)致脾胃氣機(jī)不暢，升降失司而引起。其標(biāo)在胃，其本在肝脾?；静C(jī)為胃氣失和，氣機(jī)不利。感染Hp后病證常表現(xiàn)為濕熱，Hp可傳染、易反復(fù)的特征也與中醫(yī)理論中濕熱邪氣致病的表現(xiàn)相似。因此，治療應(yīng)以疏肝和胃、行氣止痛、清熱除濕為主。肝胃百合湯是夏度衡教授的經(jīng)驗(yàn)方，夏老根據(jù)歷代醫(yī)家著述及多年行醫(yī)經(jīng)驗(yàn)，提出“后天脾胃難離肝”的觀點(diǎn)，在遣方用藥時(shí)重視肝胃之間的關(guān)系。肝乃剛臟，內(nèi)寓相火，治肝時(shí)忌用一派辛散之品，因剛燥之品使肝木愈肆、耗散脾胃氣陰，肝胃百合湯充分體現(xiàn)了夏老的這一學(xué)術(shù)主張。

研究發(fā)現(xiàn)，Hp與應(yīng)激對(duì)于胃黏膜的破壞有著協(xié)同作用，Hp會(huì)導(dǎo)致由應(yīng)激引起的消化性潰瘍的進(jìn)一步發(fā)展^[11]。TFF1是一類結(jié)構(gòu)獨(dú)特的小分子多肽，有抗腐蝕、耐酸、耐熱及抗酶分解的功能，對(duì)胃黏膜保護(hù)及損傷后修復(fù)起著重要作用，尤其對(duì)促進(jìn)黏膜愈合有特別作用^[12]。Ulaganathan M等^[13]研究發(fā)現(xiàn)，胃黏膜受損后4～28 d，TFF1及其mRNA在胃黏膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)顯著增加，表明TFF1有保持胃黏膜完整、加快潰瘍恢復(fù)、加強(qiáng)消化道黏膜自身防護(hù)能力的作用。p-ERK是ERK的活性形式，可使轉(zhuǎn)錄因子活化，促進(jìn)DNA表達(dá)，影響細(xì)胞代謝及功能同步等，對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞新陳代謝和基因表達(dá)有其獨(dú)特的作用。滿曉華等^[14]研究發(fā)現(xiàn)，p-ERK1/2在正常大鼠胃黏膜中表達(dá)極微弱，但在接受應(yīng)激刺激后，其表達(dá)顯著升高。劉密等^[15]制作應(yīng)激性胃黏膜損傷大鼠模型，檢測(cè)胃黏膜p-ERK1/2蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其ERK1/2磷酸化逐步上升，表明在損傷的胃黏膜組織自我修復(fù)過(guò)程中啟動(dòng)了細(xì)胞增殖活動(dòng)，促進(jìn)潰瘍的愈合。

本研究發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激與Hp感染雙重因素對(duì)于小鼠胃黏膜的損傷超過(guò)了慢性應(yīng)激或Hp感染單一因素對(duì)小鼠的影響，肝胃百合湯治療后，模型小鼠Hp感染和胃黏膜損傷均明顯改善，TFF1、p-ERK蛋白表達(dá)升高，說(shuō)明慢性應(yīng)激與Hp可協(xié)同致胃黏膜損傷，肝胃百合湯對(duì)慢性應(yīng)激合并Hp感染胃潰瘍有明顯的抑制和促進(jìn)愈合的作用，其機(jī)制可能與肝胃百合湯通過(guò)促進(jìn)TFF1、p-ERK表達(dá)及胃黏膜修復(fù)，減輕胃黏膜炎癥等因素有關(guān)。

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