參苓白術(shù)散對(duì)非酒精性脂肪性肝病模型大鼠瘦素及胰島素抵抗的影響

王萌 張會(huì)存 劉欣 汪紅兵

摘要：目的 ?觀察參苓白術(shù)散對(duì)非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）模型大鼠血脂、瘦素和胰島素抵抗的影響，探討其相關(guān)作用機(jī)制。方法 ?20只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為正常組5只（正常飼料喂養(yǎng)）和高脂飲食組15只，高脂飲食組大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)制作NAFLD模型，將成模大鼠隨機(jī)分為模型組、參苓白術(shù)散組和吡格列酮組，每組5只，正常組和模型組給予生理鹽水灌胃，參苓白術(shù)散組給予參苓白術(shù)散水煎液灌胃，吡格列酮組給予吡格列酮混懸液灌胃。藥物干預(yù)8周后進(jìn)行口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)大鼠糖耐量變化及血清轉(zhuǎn)氨酶、血脂、瘦素與胰島素水平，并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)。結(jié)果??與正常組比較，模型組大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶、血脂、瘦素、胰島素、血糖和胰島素抵抗指數(shù)均顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，參苓白術(shù)散組和吡格列酮組大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶、血脂、瘦素、胰島素、血糖和胰島素抵抗指數(shù)均顯著降低（P<0.05）。結(jié)論??參苓白術(shù)散通過(guò)降低模型大鼠轉(zhuǎn)氨酶與血脂水平發(fā)揮治療NAFLD作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)瘦素、改善胰島素抵抗有關(guān)。

關(guān)鍵詞：參苓白術(shù)散;胰島素抵抗;瘦素;血脂;肝功能;大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.10.009

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5 ???文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ???文章編號(hào)：1005-5304（2018）10-0035-05

Effects of Shenling Baizhu?Powder on Leptin and Insulin Resistance?ofNon-alcoholic Fatty Liver Disease Rats

WANG Meng¹， ZHANG Hui-cun²， LIU Xin²， WANG Hong-bing²

1. Medical School of Xianyang?Vocational Technical College，?Xianyang?712000， China; 2.?Beijing?Traditional Chinese Medicine Hospital， Capital Medical University， Beijing Institute of Chinese Medicine，?Beijing 100010， China.

Abstract：?Objective?To observe the effects of Shenling Baizhu Powder on blood lipid， leptin and insulin resistance of non-alcoholic fatty liver disease?（NAFLD）?rats; To explore its mechanism. Methods Twenty?rats were randomly divided into normal group （normal diet?feed，?n=5） and high-fatdiet group （high-fat diet feed，?n=15）. Rats of high-fat diet group?were fed with high-fat diet to establish NAFLD model. Model rats?were divided into model group， Shenling Baizhu?Powder group and pioglitazone group， with 5 rats in each group. Normal group and model group were given normal saline for gavage， while Shenling Baizhu?Powder group and pioglitazone group were given Shenling Baizhu Powder and pioglitazone suspension by intragastric administration respectively. After 8 weeks of medicine intervention， all rats were subjected to oral glucose tolerance test.?Serum?transaminase， blood lipid， leptin and insulin levels were detected by biochemical analysis. Insulin resistance index was calculated. Results?Compared with the normal group，?serum transaminase， blood lipid， leptin， insulin， blood glucose and insulin resistance index?increased significantly in the model group （P<0.05）. Compared with the model group，?serum transaminase， blood lipid， leptin， insulin， blood glucose and insulin resistance index in Shenling Baizhu?Powder and pioglitazone group decreased significantly （P<0.05）. Conclusion?Shenling Baizhu?Powder can conduct treatment of NAFLD by reducing the effects of transaminase and lipid levels in model rats， and the mechanism may be related to the regulation of leptin and the improvement of insulin resistance.

???Keywords： Shenling Baizhu Powder; insulin resistance; leptim; blood lipids; liver function; rats

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fat liver disease，NAFLD）患病率逐年升高，已成為慢性肝病和肝酶學(xué)異常的首要病因。有研究表明，NAFLD相關(guān)肝硬化的肝癌發(fā)生率與丙型肝炎相關(guān)肝硬化的肝癌發(fā)病率接近^[1]。NAFLD是隱源性肝硬化的重要原因之一，由于該病患病率高，病變遷延，且危害大，是目前國(guó)內(nèi)外肝病界研究的熱點(diǎn)之一^[2-5]。研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD伴有高胰島素血癥和胰島素抵抗（insulin resistance，IR），并與機(jī)體對(duì)瘦素的敏感性降低有關(guān)^[6]。白色脂肪分泌的多肽瘦素，其主要生理功能是調(diào)節(jié)糖脂代謝，主要影響機(jī)體攝食與能量代謝。當(dāng)機(jī)體攝入脂肪時(shí)，機(jī)體分泌廋素增加，在下丘腦部位，通過(guò)JAK-STAT通路產(chǎn)生抑制神經(jīng)肽Y，減少進(jìn)食并興奮交感神經(jīng)分解脂肪，調(diào)控能量代謝。但在NAFLD病理狀態(tài)下，瘦素異常導(dǎo)致高胰島素血癥，游離脂肪酸增加，肝臟分解脂肪酸失代償，最終引起肝臟的脂質(zhì)沉積，形成脂肪肝^[7]。瘦素可抑制胰島素分泌，而當(dāng)胰島素分泌增多，可反饋性促進(jìn)瘦素分泌，調(diào)控糖、脂代謝。但當(dāng)瘦素與胰島素之間的調(diào)節(jié)發(fā)生異常，IR發(fā)生，糖脂代謝發(fā)生紊亂，肝臟攝取過(guò)量的脂肪酸，脂肪在肝臟的異常堆積及炎性細(xì)胞聚集、浸潤(rùn)，導(dǎo)致NAFLD發(fā)生^[8-9]。有文獻(xiàn)報(bào)道，參苓白術(shù)散可有效作用于糖尿病患者胰島素信號(hào)通路，緩解其IR^[10-12]。本研究采用高脂飼料喂養(yǎng)制作NAFLD大鼠模型，觀察參苓白術(shù)散對(duì)NAFLD大鼠IR與瘦素的影響，探討其治療NAFLD可能的作用機(jī)制。

1 ?實(shí)驗(yàn)材料

1.1 ?動(dòng)物及飼料

清潔級(jí)SD大鼠20只，雄性，體質(zhì)量110～120 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2009-0012。飼養(yǎng)于北京市中醫(yī)研究所清潔級(jí)動(dòng)物房。高脂飼料（蛋白質(zhì)27.5%，碳水化合物65.8%，脂肪11.4% kCal/g），北京科澳協(xié)力飼料有限公司加工制作。

1.2 ?藥物

參苓白術(shù)散（人參15 g，白術(shù)15 g，茯苓15 g，薏苡仁9 g，砂仁6 g，山藥15 g，桔梗6 g，白扁豆12 g，蓮子9 g，炙甘草9 g）^[13]，飲片由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供，將上述飲片放入涼蒸餾水中，浸泡30 min，煎煮2次，將藥汁混合后過(guò)濾，濃縮至每1 mL含原藥材1 g，離心去掉殘?jiān)? ℃冰箱保存?zhèn)溆?。吡格列酮片，天津武田藥品有限公司，批?hào)155A，使用前充分研磨，0.5%羧甲基纖維素納溶液配制成作混懸液。用藥劑量按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體體表面積比等效量換算。

1.3 ?主要試劑與儀器

肝功能、血脂試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司），胰島素放免試劑盒（北京華英生物），瘦素ELISA試劑盒（博奧森生物工程有限公司）。血糖儀（美國(guó)強(qiáng)生），7160全自動(dòng)生化儀（日本日立），酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad），γ-911放射免疫分析儀（中國(guó)科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司）。

2 ?實(shí)驗(yàn)方法

2.1 ?分組、造模和給藥

實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，按隨機(jī)數(shù)字表分為正常組、模型組、吡格列酮組、參苓白術(shù)散組，每組5只。參考文獻(xiàn)[14-15]方法造模，正常組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，其余3組大鼠飼喂高脂飼料，連續(xù)8周，制作大鼠NAFLD模型。參苓白術(shù)散組大鼠給予參苓白術(shù)散水煎液（12 g/kg）灌胃，吡格列酮組大鼠給予吡格列酮混懸液（4 mg/kg）灌胃，正常組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。給藥體積為5 mL/kg，每日1次，連續(xù)8周。

2.2 ?口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)

給藥8周后，各組大鼠禁食12～14 h后，剪尾采血測(cè)定空腹血糖（FPG），然后以2 g/kg葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)灌胃，分別于灌胃后60、120 min大鼠尾靜脈取血檢測(cè)血糖。

2.3 ?取材

給藥8周后，予3%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈取血，靜置120 min，2000 r/min離心15 min，取血清，置于-20 ℃冰箱保存待測(cè)。

2.4 ?血清肝功能、血脂測(cè)定

取實(shí)驗(yàn)大鼠備用血清，分別與蘋(píng)果酸脫氫酶、乳酸脫氫酶、L-天門(mén)冬氨酸，α-酮戊二酸、L-丙氨酸化學(xué)反應(yīng)保溫1?min，測(cè)定340?nm外吸光度，獲得各組血清轉(zhuǎn)氨酶值。使用7160全自動(dòng)生化儀，按血脂試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定大鼠三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）。

2.5 ?血清胰島素測(cè)定

加入聚苯乙烯試管并相應(yīng)編號(hào)后，分別加各組實(shí)驗(yàn)大鼠血清及標(biāo)準(zhǔn)品各100 μL，各管分別加入胰島素抗體100?μL與I¹²⁵標(biāo)記胰島素100?μL， 4 ℃混勻，反應(yīng)24 h;加分離劑500?μL，4?℃、3500?r/min離心15 min，吸棄上清液，應(yīng)用γ-911放射免疫分析儀自動(dòng)檢測(cè)沉淀的CPM值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組大鼠血清胰島素（FINS）水平。

2.6 ?血清瘦素測(cè)定

①將各種試劑移至室溫平衡30 min，取濃縮洗滌液，根據(jù)當(dāng)批檢測(cè)數(shù)量，用蒸餾水1∶20稀釋?zhuān)靹蚝髠溆?。②?biāo)準(zhǔn)品及質(zhì)控品第1次使用前用0.5 mL蒸餾水溶解后充分搖勻，靜置10 min后使用。③將預(yù)包被板從密封袋中取出，設(shè)空白對(duì)照孔，不加任何液體;每個(gè)校準(zhǔn)點(diǎn)依次各設(shè)2孔，每孔加入相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品50 μL;其余檢測(cè)孔直接加質(zhì)控品或待測(cè)血清50 μL。然后各孔加入酶標(biāo)抗體50 μL，充分混勻，貼上封板膜，置于37 ℃溫育1 h。④手工洗板：棄去孔內(nèi)液體，洗滌液注滿各孔，靜置10 s甩干，重復(fù)3次后拍干;洗板機(jī)洗板：選擇洗滌3次程序洗板后拍干。⑤每孔加顯色劑A液50 μL，顯色劑B液50 μL，振蕩混勻，置于37 ℃避光顯色15 min，每孔加終止液50 μL。⑥用酶標(biāo)儀讀數(shù)，先用空白對(duì)照孔調(diào)零點(diǎn)，然后測(cè)定各孔吸光度，計(jì)算樣品濃度。

2.7 ?胰島素抵抗指數(shù)計(jì)算

根據(jù)穩(wěn)態(tài)模型HOMA，計(jì)算IR指數(shù)（HOMA-IR），HOMA-IR=FPG（mmol/L）×FINS（mIU/L）÷22.5。

3 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以 x（—）±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 ?結(jié)果

4.1 ?參苓白術(shù)散對(duì)模型大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，吡格列酮組和參苓白術(shù)散組大鼠血清ALT、AST水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

4.2 ?參苓白術(shù)散對(duì)模型大鼠血清血脂水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清TG、TC和LDL-C水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，吡格列酮組和參苓白術(shù)散組大鼠血清TG、TC與LDL-C水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但對(duì)HDL-C影響不明顯。結(jié)果見(jiàn)表2。

4.3 ?參苓白術(shù)散對(duì)模型大鼠血清胰島素和瘦素水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清FINS、瘦素水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，吡格列酮組和參苓白術(shù)散組大鼠血清FINS、瘦素水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3。

4.4 ?參苓白術(shù)散對(duì)模型大鼠口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)的影響

與正常組比較，模型組大鼠血糖60、120 min時(shí)均升高，120 min時(shí)血糖差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，吡格列酮組和參苓白術(shù)散組大鼠血糖60 min變化不明顯，120 min時(shí)吡格列酮組和參苓白術(shù)散組血糖明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表4。

4.5 ?參苓白術(shù)散對(duì)模型大鼠胰島素抵抗指數(shù)的影響

與正常組比較，模型組大鼠HOMA-IR明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，吡格列酮組和參苓白術(shù)散組大鼠HOMA-IR顯著降低（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表5。

5 ?討論

NAFLD患者肝臟存在IR，構(gòu)成了NAFLD的發(fā)病基礎(chǔ)并與NAFLD的病情進(jìn)展緊密關(guān)聯(lián)^[16]。瘦素是由機(jī)體的肥胖基因（Ob基因）經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯表達(dá)形成的脂肪源性激素，該激素通過(guò)分布于中樞與外周的瘦素受體蛋白，調(diào)控脂肪代謝及能量消耗^[17]，當(dāng)NAFLD瘦素水平異常升高可導(dǎo)致IR，該生理現(xiàn)象稱(chēng)為瘦素抵抗，IR和瘦素抵抗共同促進(jìn)了NAFLD疾病的發(fā)生與發(fā)展。瘦素抵抗在NAFLD發(fā)病中具有重要作用^[18-19]。NAFLD患者表現(xiàn)出血清瘦素水平升高與瘦素抵抗的病理表現(xiàn)，表明血清瘦素水平可幫助臨床早期診斷NAFLD，臨床實(shí)踐中也發(fā)現(xiàn)，改善瘦素抵抗藥物亦可改善IR，阻止NAFLD病情的發(fā)展，NAFLD患者瘦素水平與胰島素抵抗指數(shù)呈獨(dú)立正相關(guān)^[20]。

脂肪組織經(jīng)胰島素刺激后，高表達(dá)瘦素并控制飲食，當(dāng)抑制胰島素分泌，降低胰島素，可顯著減少瘦素的形成。同時(shí)瘦素可促進(jìn)分解TG，形成游離脂肪酸（FFA），F(xiàn)FA影響肌肉對(duì)胰島素的敏感及肝糖輸出，并降低對(duì)胰島素的滅活，F(xiàn)FA可刺激胰島分泌胰島素，形成高胰島素血癥與IR^[21-24]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為NAFLD病因與嗜食肥甘厚味、多逸少勞有關(guān)，其病位在肝，與脾、腎等臟腑密切相關(guān)，由脾、腎、肝三臟功能失調(diào)，痰瘀互結(jié)，停積于肝所致。脾虛痰瘀為NAFLD主要病機(jī)。

參苓白術(shù)散中人參大補(bǔ)脾胃之氣，白術(shù)、茯苓健脾滲濕，山藥、蓮子健脾兼以澀腸止瀉，白扁豆、薏苡仁健脾化濕，砂仁芳香醒脾，暢達(dá)氣機(jī)，桔梗通利水道、且能載藥上行，炙甘草健脾和中，調(diào)和藥性，諸藥相合，可補(bǔ)脾胃祛痰飲，有效緩解機(jī)體水濕停聚，降低肝糖原的減少，改善糖代謝。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NAFLD大鼠經(jīng)高脂飼料誘導(dǎo)后，其肝功能和血脂出現(xiàn)異常，表明高脂飼料對(duì)肝臟造成一定損傷，NAFLD造模成功?？诜咸烟悄土繉?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，葡萄糖灌胃大鼠120 min后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血糖升高，表明高脂飼料對(duì)大鼠胰島素信號(hào)通路產(chǎn)生影響，經(jīng)參苓白術(shù)散和吡格列酮干預(yù)后，與模型組比較，各給藥組大鼠120 min血糖顯著降低，表明參苓白術(shù)散和吡格列酮均可顯著改善高脂造成的糖耐量降低及其誘發(fā)的IR;NAFLD大鼠經(jīng)吡格列酮和參苓白術(shù)散干預(yù)后，血脂、瘦素、血糖與HOMA-IR均顯著改善。

綜上，參苓白術(shù)散通過(guò)降低模型大鼠轉(zhuǎn)氨酶與血脂水平發(fā)揮治療NAFLD作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)瘦素、改善IR有關(guān)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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