Dax1與胚胎干細(xì)胞多能因子Oct4、Sox2、Nanog及Esrrb相互作用的研究進(jìn)展

孫慧林 楊 丹 胡 喆

廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，廣東湛江 524001

胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）是一種源自囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)具有無限自我增殖更新能力和多向分化潛能的細(xì)胞，能被誘導(dǎo)生成各種組織細(xì)胞[1]。其特性為某些疑難疾病的治療提供了希望，并引起了廣泛的關(guān)注。由自身體細(xì)胞誘導(dǎo)形成的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，IPSCs）解決了干細(xì)胞來源困難、免疫排斥、倫理爭(zhēng)議等難題。干細(xì)胞生物學(xué)研究是醫(yī)學(xué)前沿重點(diǎn)發(fā)展領(lǐng)域之一，其在心肌梗死[2]、脊髓損傷[3]、糖尿病[4]、阿爾茨海默病[5]等領(lǐng)域的相關(guān)研究如日方升，展現(xiàn)了良好的發(fā)展前景。原國(guó)家衛(wèi)計(jì)委與藥監(jiān)局聯(lián)合發(fā)布《干細(xì)胞臨床研究管理辦法（試行）》、《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則（試行）》及《2017干細(xì)胞及轉(zhuǎn)化研究”國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃專項(xiàng)指南》等文件，旨在使干細(xì)胞機(jī)制研究和臨床轉(zhuǎn)化研究發(fā)展更為健康；首批干細(xì)胞臨床研究機(jī)構(gòu)的成立、首批干細(xì)胞與轉(zhuǎn)化研究重大研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目的正式啟動(dòng)，標(biāo)志著中國(guó)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化研究的正式起航。

1 ESCs與Dax1

ESCs有兩大眾所周知的特性，即可不斷自我更新和分化為各種組織細(xì)胞。該特性的維持涉及多種多能轉(zhuǎn)錄因子，包括“核心轉(zhuǎn)錄因子”（Oct4、Sox2、Nanog）和 STAT3、Klf4、雌激素相關(guān)受體 β（Esrrb）等；此外，還包括表觀遺傳修飾子、microRNA等；其互相調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)非常復(fù)雜且有冗余[6]。另外，外在信號(hào)對(duì)ESCs也很重要。白血病抑制因子LIF通過與細(xì)胞膜上LIFR/gp130受體結(jié)合激活JAK-STAT途徑，調(diào)節(jié)多能因子表達(dá)而維持ESCs特性[7]。ESCs轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的重要調(diào)節(jié)基因間的相互調(diào)節(jié)機(jī)制研究有助于干細(xì)胞轉(zhuǎn)化研究。

Dax1，也稱為 Nr0b1、Ahch，是一種非典型核受體蛋白，屬核激素受體超家族，為一種轉(zhuǎn)錄抑制因子抑制類固醇生成[8]。Dax1在ESCs中高表達(dá)，且在桑椹胚和囊胚發(fā)育階段前的上胚層中廣泛表達(dá)[9]。Dax1是ESCs代謝調(diào)節(jié)因子，而代謝與胚胎發(fā)育緊密相關(guān)，提示Dax1可能與ESCs多能維持和分化有關(guān)[10]。Dax1在多能性和胚胎發(fā)育中有重要作用的第一個(gè)跡象是Dax1敲除小鼠造模失敗[10]。撤除ESCs培養(yǎng)環(huán)境中LIF，誘導(dǎo)分化12 h時(shí)Dax1 mRNA下調(diào)，推測(cè)Dax1表達(dá)依賴于LIF[11]。敲除Dax1會(huì)誘導(dǎo)ESCs內(nèi)胚層標(biāo)志基因Gata4、Gata6表達(dá)增加而向內(nèi)胚層分化[12]，并降低ESCs細(xì)胞活力和增殖[13]。這可能是多個(gè)實(shí)驗(yàn)室嘗試建立Dax1敲除小鼠均失敗的原因。聚類分析研究ESCs中多能轉(zhuǎn)錄因子差異調(diào)節(jié)的潛在機(jī)制，發(fā)現(xiàn)Dax1與多個(gè)多能轉(zhuǎn)錄因子有相似性和相關(guān)性[14]。綜上所述，Dax1參與維持ESCs自我更新和多能分化。

2 Dax1與Oct4

Oct4也被稱為POU5F1，屬于POU家族的轉(zhuǎn)錄因子，是ESCs多能轉(zhuǎn)錄因子中的關(guān)鍵之一；其表達(dá)上調(diào)和下調(diào)均可誘導(dǎo)ESCs分化且對(duì)劑量變化很敏感，上調(diào)50%可致原始內(nèi)胚層分化，而下調(diào)50%則可致滋養(yǎng)外胚層分化[15]。此外，Oct4是IPSCs產(chǎn)生所必需的，這表明Oct4對(duì)獲得多能性的十分重要[16]。質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)Dax1、Sox2及Esrrb均能與Oct4共定位并相互作用，且敲除Oct4后Dax1表達(dá)下調(diào)，ESCs有分化傾向；同時(shí)，Oct4與Dax1啟動(dòng)子/增強(qiáng)子結(jié)合并正向調(diào)節(jié)Dax1表達(dá)，即Dax1是Oct4的正向直接下游[11,17]。然而，Dax1過表達(dá)能抑制Oct4啟動(dòng)子的激活，從而抑制Oct4轉(zhuǎn)錄活性，并導(dǎo)致ESCs分化，推測(cè)Dax1作為Oct4正性調(diào)節(jié)下游可負(fù)性反饋調(diào)節(jié)Oct4，充當(dāng)Oct4的“精細(xì)調(diào)節(jié)器”，以保持Oct4在ESCs中適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)水平[18]。Dax1還可能通過負(fù)向調(diào)控類固醇合成因子LRH-1來抑制Oct4的表達(dá)[18]。Dax1能通過LRH-1近端啟動(dòng)子位點(diǎn)激活Oct4啟動(dòng)子而上調(diào)Oct4的表達(dá)[19]。Dax1還能與類固醇受體RNA激活劑SRA相互作用，激活Oct4轉(zhuǎn)錄；Oct4也能通過Dax1內(nèi)含子中的一個(gè)位點(diǎn)參與調(diào)節(jié)Dax1的表達(dá)[19]。綜上所述，推測(cè)Dax1對(duì)Oct4存在雙向反饋調(diào)節(jié)，低水平Oct4誘導(dǎo)的Dax1表達(dá)能正反饋上調(diào)Oct4的表達(dá)，而高水平Oct4誘導(dǎo)的Dax1表達(dá)能負(fù)反饋抑制Oct4的轉(zhuǎn)錄活性，前者有助于維持Oct4的正常水平，后者能防止Oct4過高引起分化，該機(jī)制有利于快速、精細(xì)調(diào)節(jié)Oct4的表達(dá)水平。

3 Dax1與Sox2

Sox2屬Sox家族，為“核心轉(zhuǎn)錄因子”之一，在LIF信號(hào)傳導(dǎo)通路的下游激活Klf4而參與多能性維持[20]。ESCs轉(zhuǎn)錄因子聚類分析，發(fā)現(xiàn)Dax1與Sox2有一定的相似性和相關(guān)性[14]。Esrrb能與Sox2特異性結(jié)合，而Esrrb/Sox2雙敲除后能使Dax1表達(dá)下調(diào)，研究其機(jī)制發(fā)現(xiàn)，Esrrb和Sox2靶向作用于Dax1啟動(dòng)子而激活其表達(dá)，并在ESCs和外胚層細(xì)胞中起重要調(diào)控作用[21]。即Dax1可能也是Esrrb-Sox2復(fù)合體的下游，并在阻滯ESCs向外胚層分化中起一定作用。

4 Dax1與Nanog

Nanog是促進(jìn)ESCs自我更新的“核心轉(zhuǎn)錄因子”，其過表達(dá)能賦予ESCs不依賴LIF的自我更新能力[22]，還能通過抑制Gata6表達(dá)而阻滯ESCs向內(nèi)胚層分化[23]。Nanog高表達(dá)能促進(jìn)體細(xì)胞重編程后期獲得多能狀態(tài)及激活內(nèi)源性Nanog、Oct4，這是去分化中間體（pre-iPS）轉(zhuǎn)變?yōu)?IPSCs所必需的[24]。有研究[25]指出，在ESCs中敲低Nanog對(duì)Dax1的表達(dá)水平?jīng)]有影響，故Nanog不可能調(diào)節(jié)Dax1的表達(dá)。然而，通過CHIP和EMSA分析，發(fā)現(xiàn)Dax1能以O(shè)ct4依賴的方式結(jié)合Nanog的近端啟動(dòng)子[17]，且Dax1與Nanog有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)[14,26]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Nanog能在Dax1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)+2770處結(jié)合而增強(qiáng)LRH-1結(jié)合-128核受體結(jié)合元件，使Dax1表達(dá)的上調(diào)[27]。細(xì)胞表型分析發(fā)現(xiàn)Dax1的功能類似于 Nanog，ESCs中敲除 Nanog或Dax1不影響另一方的表達(dá)，但是Dax1敲除表型能部分由Nanog過表達(dá)挽回，反之亦然；Dax1和Nanog同時(shí)敲除顯示出表型累加效應(yīng)，高通量實(shí)驗(yàn)也表明Dax1和Nanog是ESCs多能性網(wǎng)絡(luò)中的兩個(gè)獨(dú)立的“樞紐”；若假設(shè)Dax1僅僅是Nanog的下游（或相反）則無法解釋上述結(jié)果，故認(rèn)為Dax1和Nanog在功能上是獨(dú)立的，且部分重疊、互補(bǔ)，但互相不可替代[28]。Dax1和Nanog形成了一個(gè)“雙保險(xiǎn)”機(jī)制，有利于穩(wěn)定ESCs最佳的多能狀態(tài)，提高自我更新效率；此外，Dax1與Nanog均能促進(jìn)重編程細(xì)胞從pre-iPS轉(zhuǎn)變?yōu)镮PSCs[28]。

5 Dax1與Esrrb

Esrrb也稱NR3B2，與Dax1同屬核受體家族，是ESCs核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)成員，與Oct4、Nanog等轉(zhuǎn)錄因子有相互作用[29]。Esrrb與Sox2形成Esrrb-Sox2復(fù)合體，作用于Dax1啟動(dòng)子，誘導(dǎo)其表達(dá)而阻滯外胚層分化[21]。Esrrb被確定為Dax1相互作用蛋白，通過Dax1的LXXLL基序和Esrrb的活化配體結(jié)合域結(jié)合介導(dǎo)，Esrrb還能直接結(jié)合Dax1啟動(dòng)子的Esrrb結(jié)合位點(diǎn)1（ERRE1），正調(diào)節(jié)Dax1基因啟動(dòng)子活性，且即使無Oct4，Esrrb過表達(dá)也可維持Dax1的表達(dá)，這表明Esrrb是Dax1的上游，且能以O(shè)ct4非依賴方式正向調(diào)節(jié)Dax1表達(dá)[30]。此外，Esrrb和Oct4的轉(zhuǎn)錄活性受到Dax1的抑制，Dax1-Esrrb相互作用的抑制引起內(nèi)胚層基因表達(dá)上調(diào)；結(jié)合已有研究，發(fā)現(xiàn)Esrrb過表達(dá)易致內(nèi)胚層分化，提示Esrrb增強(qiáng)內(nèi)胚層基因表達(dá)，從而誘導(dǎo)ESCs分化成內(nèi)胚層；而Dax1通過與Esrrb相互作用抑制內(nèi)胚層基因表達(dá)，從而阻止ESCs分化。Oct4與Esrrb相互作用并誘導(dǎo)Dax1的表達(dá)，而Dax1為Esrrb和Oct4的負(fù)調(diào)控因子形成調(diào)控環(huán)[30]。Esrrb與核受體共激活因子3（Ncoa3）結(jié)合，識(shí)別Gata6啟動(dòng)子的Esrrb識(shí)別基序ERRE2，直接誘導(dǎo)Gata6表達(dá)，從而誘導(dǎo)ESCs向內(nèi)胚層分化；Dax1抑制Gata6啟動(dòng)子上的Esrrb結(jié)合活性及Ncoa3轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制Gata6表達(dá)，阻滯其分化[29]?？傊?，Esrrb能單獨(dú)或與Sox2形成復(fù)合體，并作用于Dax1啟動(dòng)子而正向調(diào)節(jié)Dax1；Dax1能負(fù)反饋調(diào)節(jié)Esrrb，且Dax1還能通過抑制Gata6啟動(dòng)子上的Esrrb結(jié)合活性及Ncoa3轉(zhuǎn)錄活性而抑制ESCs分化。

6 小結(jié)和展望

ESCs細(xì)胞狀態(tài)維持需要一個(gè)復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，且該網(wǎng)絡(luò)中的元素不斷擴(kuò)增，包括Dax1等。ESCs中Dax1高表達(dá)，而在撤除LIF誘導(dǎo)分化后表達(dá)下調(diào)。Dax1敲除后ESCs有內(nèi)胚層分化傾向，且Dax1敲除小鼠建模嘗試失敗。在ESCs中Dax1能與Oct4、Sox2、Nanog和Esrrb等相互作用而參與ESCs特性維持和分化阻滯。Dax1可能是Oct4、Sox2和Esrrb的下游正性調(diào)節(jié)基因；反之，Dax1對(duì)Oct4有雙向反饋調(diào)節(jié)，有助于嚴(yán)格維持Oct4的正常表達(dá)水平；Dax1能負(fù)反饋調(diào)節(jié)Esrrb，其通過抑制Gata6啟動(dòng)子上的Esrrb結(jié)合活性及Ncoa3轉(zhuǎn)錄活性來抑制Esrrb過表達(dá)引起的ESCs分化。Dax1與Nanog功能相似互補(bǔ)，但不可互相替代。它們形成了“雙保險(xiǎn)”機(jī)制，有助于穩(wěn)定ESCs細(xì)胞狀態(tài)，且其在重編程過程中起相似的促進(jìn)作用?？偨Y(jié)Dax1與該四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子間相互作用，見圖1。

核受體基因家族對(duì)于調(diào)控發(fā)育、分化和體內(nèi)平衡非常重要，研究了解核受體在ESCs中的功能意義重大。LRH1、DAX1和Esrrb在多能性維持中發(fā)揮重要作用，而核受體GCNF、COUP-TF在分化中起重要作用[31]。核受體是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，可被小分子激動(dòng)劑和拮抗劑調(diào)節(jié)，故其在促進(jìn)ESCs和iPSCs再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究中具有巨大潛力。Dax1、Esrrb等核受體基因在ESCs轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)和誘導(dǎo)產(chǎn)生IPSCs過程中的功能、地位、及其與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用機(jī)制均有待進(jìn)一步研究。

圖1 Dax1與四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子間相互關(guān)系