動態(tài)pH聯(lián)接-掃集聯(lián)用間接紫外法測定復(fù)方氨基酸注射液中酸性氨基酸含量

郭海龍 徐小英 李玉珍

中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院（深圳福田）藥學(xué)部，廣東深圳 518033

氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單元，也是體內(nèi)重要的生物活性物質(zhì)[1-2]。谷氨酸（Glu）被人體吸收后，易與血氨形成谷氨酰胺，能解除代謝過程中氨的毒害作用，因而能預(yù)防和治療肝昏迷，保護肝臟。Glu對胃腸道也具有重要保護作用[3]。天冬氨酸（Asp）可以提供機體所需能量，參與其他氨基酸的代謝，是生物體內(nèi)賴氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸等氨基酸及嘌呤、嘧啶堿基的合成前體。Asp參與鳥氨酸循環(huán)，促進氧和二氧化碳生成尿素，降低血液中氮和二氧化碳的量，增強肝臟功能，消除疲勞。Asp還可作為K+、Mg2+的載體向心肌輸送電解質(zhì)，從而改善心肌收縮功能，同時降低氧消耗，在冠狀動脈循環(huán)障礙缺氧時，對心肌有保護作用。Glu是構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸之一，雖然它不是人體必須的氨基酸，但它可作為碳氮營養(yǎng)參與機體代謝，有較高的營養(yǎng)價值。研究顯示，Glu和Asp是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)[4-5]，腫瘤周圍組織中Glu、Asp濃度增加可能導(dǎo)致膠質(zhì)瘤繼發(fā)性癲癇[6]。Asp和Glu可促進人體骨骼和牙齒的主要無機組成成分——羥基磷灰石的形成[7]，還可能有助于誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡[8]。因此，復(fù)方氨基酸注射液中Glu和Asp對于人體顯得尤為重要，檢測其含量具有重要意義。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

P/ACEMDQ毛細管電泳儀（貝克曼庫爾特有限公司，美國）；未涂層熔融石英毛細管（50 cm×50 μm I.D.×375 μm O.D.，有效長度為40 cm，永年縣銳灃色譜器件有限公司）；紫外檢測波長為214 nm，PA800 Plus生物制藥分析系統(tǒng)32 Karat軟件（貝克曼庫爾特有限公司，美國）；超純水裝置（Millipore，美國）；電子分析天平（AG285，梅特勒-托利多，瑞士）；數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9076 MBE，博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；超聲波清洗器（KQ-250DB型，予華儀器責(zé)任有限公司）；PHS-25-01型實驗室pH計（艾普計算儀器有限公司）。

1.2 試劑

復(fù)合氨基酸注射液[中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院（深圳福田）（以下簡稱“我院”）采購]；Asp和 Glu標準品（J&K 中國化工有限公司）；β-環(huán)糊精（β-CD）（奧博星生物技術(shù)有限公司）；鹽酸、磷酸（H3PO4）、苯甲酸（BA）和三羥甲基氨基甲烷（Tris）為分析試劑級并符合標準。所有的溶液用蒸餾水配制。

1.3 溶液配制

用3 mmol/L H3PO4溶液分別配制Glu和Asp的標準儲備液（均為100 μg/mL）。復(fù)方氨基酸注射液樣品用3 mmol/L H3PO4溶液進行適當(dāng)稀釋制備成不同濃度的溶液。運行緩沖液（pH 7.5）由10 mmol/L Tris、10 mmol/L β-CD和8 mmol/L BA組成，實驗當(dāng)天用100 mmol/L Tris、20 mmol/L BA等儲備液和β-CD粉末配制。所有的溶液在使用前用孔徑為0.45 μm的微孔濾膜過濾。

1.4 儀器操作

新的毛細管在使用前用1 mol/L NaOH沖洗1 h，然后用雙蒸水沖洗10 min。每天使用前，毛細管依次用蒸餾水、100 mmol/L NaOH、蒸餾水和緩沖液各沖洗5 min。同時預(yù)熱CE儀器，使其基線穩(wěn)定。進樣間隙，毛細管依次用蒸餾水、100 mmol/L NaOH和蒸餾水分別沖洗2 min，然后緩沖液平衡3 min。每天使用完之后，毛細管用蒸餾水（2 min）、100 mmol/L NaOH（5 min）和蒸餾水（2 min）沖洗，并保存在蒸餾水中。采用壓力進樣。

2 實驗原理

2015年，有研究者采用動態(tài)pH聯(lián)接與掃集兩種毛細管電泳在線富集技術(shù)，以β-CD為絡(luò)合劑，建立了測定血清中酸性氨基酸的新方法[9-10]，本實驗以Britz-McKibbin等[11]的研究為基礎(chǔ)。動態(tài)pH聯(lián)接是利用氨基酸的兩性特點，即其在不同pH條件下所帶電荷、遷移方向和速率不同而實現(xiàn)富集的。Glu和Asp的pI值分別為3.22和2.79，在樣品溶液（pH 2.5）中帶正電荷（圖1a），在運行緩沖液（pH 7.5）中帶負電荷。在毛細管兩端施加電壓后，帶正電荷的Glu和Asp在pH 2.5溶液中向陰極遷移。到達樣品區(qū)前端進入運行緩沖液區(qū)時，Glu和Asp由帶正電荷變?yōu)閹ж撾姾桑w移方向發(fā)生改變，被測組分的遷移速率迅速減小，從而在樣品區(qū)前端富集（圖1b）。進入運行緩沖液后，被測組分與β-CD結(jié)合被掃集，實現(xiàn)第2次富集（圖1c）。Glu和Asp能與β-CD結(jié)合，主要有兩個原因：一是Asp和Glu都是小分子化合物，能夠進入到β-CD的空腔內(nèi)；二是Asp和Glu均含有羧基，可與β-CD上的羥基形成氫鍵。富集完成后，被測組分通過區(qū)帶毛細管電泳模式進行分離（圖1d）。

圖1 動態(tài)pH聯(lián)接-掃集富集機制示意

3 方法與結(jié)果

3.1 電泳條件的確定

參考文獻[9-10]，確定本研究采用的條件如下：運行緩沖液（pH 7.5）由 10 mmol/L Tris、8 mmol/L BA 和10 mmol/L β-CD組成；樣品基質(zhì)為3 mmol/L H3PO4溶液（pH 2.5），采用壓力進樣，進樣壓力為 1.0 psi，進樣時間為53 s；運行電壓為12 kV；以BA為紫外探針，采用間接紫外檢測法，檢測波長為214 nm。

3.2 專屬性試驗

取一復(fù)方氨基酸注射液樣品，按照“3.1”項下條件進行測定，記錄色譜圖并通過在樣品中加入標準品（2.0 μg/mL的Glu和Asp的標準混合液）進一步確定樣品峰。Glu的峰能與系統(tǒng)峰完全分離，Glu和Asp之間的分離度為2.5，結(jié)果表明系統(tǒng)專屬性良好。

3.3 線性關(guān)系考察

在上述選定的實驗條件下，分析了7個不同濃度（0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 μg/mL） 的 Glu 和 Asp 混合溶液的峰面積和濃度之間的回歸方程。Glu的標準曲線為：y1=8918.4 x1-634.52 （r=0.9967），Asp 的標準曲線為：y2=10 036x2-503.28（r=0.9981）。 結(jié)果表明Glu和Asp均在0.2～8.0 μg/mL范圍內(nèi)獲得了良好的線性關(guān)系。

3.4 精密度試驗

日內(nèi)精密度為2.0 μg/mL的標準混合液重復(fù)6次進樣所得。通過計算得到Glu和Asp的日內(nèi)RSD分別為1.47%和1.87%。日間精密度為連續(xù)6 d測得2.0 μg/mL的標準混合液中的Glu和Asp濃度，計算其RSD，結(jié)果分別為1.58%和1.95%。

3.5 穩(wěn)定性考察

取一復(fù)方氨基酸注射液樣品，分別于放置0、1、8、24、48、72 h后進樣測定 Glu和 Asp濃度，并計算得到其峰面積的RSD分為1.49%和2.13%。結(jié)果表明樣品溶液在72 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.6 加樣回收率試驗

配制不同濃度的標準品混合溶液，加入到已知濃度的復(fù)方氨基酸注射液樣品中進行測定，通過標準曲線計算測量值，并計算回收率，測得量為減去已知濃度的結(jié)果。見表1。

表1 回收率試驗（n=3）

3.7 檢測限和富集倍數(shù)的計算

取2.0 μg/mL的標準混合液進樣3次，用峰高的平均值及信噪比（S/N=3）計算檢測限（LOD），得到Glu和Asp的LOD分別為0.093、0.054 μg/mL。富集倍數(shù)（SEF）通過與常規(guī)方法（以BGS為樣品基質(zhì)，進樣時間為 5 s）比較 LOD，計算得到 Glu和 Asp的 SEF分別為30和55。

3.8 樣品含量測定

對我院使用的2種復(fù)方氨基酸注射液的樣品進行了檢測，每種氨基酸檢測3個批次，每個批次隨機抽取3瓶，每瓶測定3次，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示2種復(fù)方氨基酸注射液的3個批次的樣品中Glu和Asp含量為其標示量的95.9%～104.7%，均在2015年版《中國藥典》[12]規(guī)定的復(fù)方氨基酸注射液（18AA）中Asp和Glu應(yīng)為標示的80.0%～120.0%、復(fù)方氨基酸注射液（18AA-Ⅱ）中Asp和Glu應(yīng)為標示量的85.0%～115.0%含量限度范圍內(nèi)。

表2 復(fù)方氨基酸注射液中Glu和Asp的檢測（n=3）

4 討論

紫外檢測器可以直接測定一些芳香族氨基酸。而非芳香族氨基酸在可見光和近紫外區(qū)域沒有吸收，也不發(fā)射熒光，因此需要通過柱前或柱后衍生化的方法進行紫外可見吸收或熒光檢測[13-14]。柱前衍生化需加入生色團與氨基酸進行化學(xué)反應(yīng)，這既繁瑣又耗時。間接紫外檢測則不需要對待測組分進行衍生，而是在背景溶液中加入發(fā)色離子使運行溶液的紫外吸收增強，待測組分通過檢測器時吸光度會減小而被檢測出[15]。采用間接紫外檢測法既可節(jié)省大量時間，又可節(jié)約試劑，適合用于較多樣品的檢測。

毛細管電泳（CE）從一出現(xiàn)就以其分離效率高、分析速度快、適用性強和進樣量?。╪L級）的特點而迅速受到了分析研究者的青睞[16-18]。在CE中，通常用熒光檢測器、紫外檢測器和質(zhì)譜檢測器等檢測方法來分析檢測氨基酸[19-21]。其中，紫外檢測器因其低成本以及樣品處理要求相對寬松而更受歡迎。但其只能檢測有紫外吸收的氨基酸，如苯丙氨酸等。因此，間接紫外檢測法應(yīng)運而生。CE聯(lián)合間接紫外檢測法的主要缺點是靈敏度低，這是由在線紫外檢測的光通路路徑短和進樣量小導(dǎo)致的。為了增大進樣量，發(fā)明了在線富集技術(shù)，通過改變緩沖液和樣品性質(zhì)進行濃縮富集，實現(xiàn)檢測靈敏度的提高[22]。

本研究采用動態(tài)pH聯(lián)接-掃集富集技術(shù)聯(lián)合間接紫外檢測法，對我院采購的兩種含有Glu和Asp的復(fù)方氨基酸注射液進行檢測，檢測結(jié)果與復(fù)方氨基酸注射液中Glu和Asp標注濃度基本相同，測量結(jié)果占標示量的百分比在95.9%～104.7%范圍內(nèi)，符合復(fù)方氨基酸注射液的質(zhì)量標準，同時也說明了Xu等[9]建立的檢測酸性氨基酸的方法具有實用性，可用于批量檢測復(fù)方氨基酸注射液樣品。