補陽還五湯中黃芪藥材的煎煮動力學(xué)模型的建立

梁順光 王圣鑫 王利勝

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006；2.廣東省監(jiān)獄中心醫(yī)院藥械科，廣東廣州 510430

補陽還五湯全方由黃芪、當歸尾、赤芍、川芎、紅花、桃仁、地龍7味中藥組成，出自《醫(yī)林改錯》，是清代名醫(yī)王清任創(chuàng)立的益氣活血名方，主治半身不遂、言語不利、口眼歪斜等癥狀。本方重用黃芪峻補元氣，少佐活血化瘀之品，諸藥合用，使氣旺血行、瘀祛絡(luò)通[1]。

黃芪，為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根[2]。 黃芪作為補陽還五湯的君藥，具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血等功效，其中黃芪中的黃芪甲苷主要起補氣養(yǎng)血作用[3-5]，毛蕊異黃酮葡萄糖苷主要起保護神經(jīng)的作用[6-8]?，F(xiàn)今對于黃芪的研究主要集中于單味藥、藥對、復(fù)方中劑量以及煎煮方式器具，對于黃芪在補陽還五湯中煎煮動力學(xué)的研究幾乎沒有，本研究擬對黃芪主要有效成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷在補陽還五湯中進行煎煮動力學(xué)的研究。

本研究對補陽還五湯中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的煎煮動力學(xué)進行研究，建立煎煮動力學(xué)模型，以Fick擴散定律為基礎(chǔ)，推算出方程參數(shù)，將測定結(jié)果代入數(shù)學(xué)模型進行方程擬合。為定量研究中藥復(fù)方煎煮動力學(xué)規(guī)律奠定理論和實驗基礎(chǔ)，為補陽還五湯生產(chǎn)提取和中成藥研制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 藥物與試劑

毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號：170105002）；黃芪、當歸尾、川芎、赤芍、紅花、桃仁、地龍均購于廣州清平中藥材市場，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院張丹雁教授鑒定為正品，飲片性狀均符合2015版《中國藥典》。甲醇、乙腈為色譜純；超純水為實驗室自制；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

戴安U-3000高效液相色譜系統(tǒng)（美國Thermo Scientific公司）包括U3000四元梯度泵、ASI-100自動進樣器、DAD-3000檢測器、變色龍色譜工作站；RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮儀器廠）；SKM型數(shù)字顯恒溫電熱套（山東甄城光明儀器有限公司）；AUW120D十萬分之一電子天平（日本島津公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芪應(yīng)用于補陽還五湯中煎煮有效成分的含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：安捷倫 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B），采用梯度洗脫，程序見表 1；流速：1 mL/min；檢測波長：230 nm；進樣量；10 μL[9-12]。毛蕊異黃酮葡萄糖苷在此流動相下色譜峰明顯且無雜質(zhì)峰，見圖1~3。

表1 洗脫程序

圖1 毛蕊異黃酮葡萄糖苷標準品色譜圖

圖2 補陽還五湯樣品色譜圖

圖3 補陽還五湯陰性（缺黃芪）色譜圖

2.1.2 對照品溶液的制備

精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量，置于10 mL量瓶中加甲醇至刻度線，充分搖勻，制成0.05 mg/mL的對照品溶液。

2.1.3 補陽還五湯樣品溶液的制備

取1份補陽還五湯處方量（黃芪60 g、當歸尾9 g、川芎 6 g、赤芍 9 g、紅花 9 g、桃仁 9 g、地龍 9 g）置于三口圓底燒瓶中，浸泡30 min，用8倍量水（pH 8.2）提取 1 h，于（沸騰后開始計時）0、5、10、15、20、30、40、50、60 min吸取3 mL藥液并補足重量，吸取出的藥液加無水乙醇至體積分數(shù)達70%，攪拌，放置至無沉淀物生成，抽濾，濾液回收乙醇，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察

取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品0.50 mg，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品儲備液。分別吸取上述毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品儲備液0.25、0.50、0.75、1.00、1.20、1.50 mL，分別置于 5 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品梯度溶液。分別精密量取上述毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品梯度溶液10 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積值。以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線并進行線性回歸。毛蕊異黃酮葡萄糖苷回歸方程：y=35.95x-0.3605，R2=0.9999，結(jié)果表明，毛蕊異黃酮葡萄糖苷進樣量與峰面積在2.50～15.00 μg之間線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗

取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液，重復(fù)測定6次，分別測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷。各色譜峰相對峰面積的RSD為1.07%，說明儀器的精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗

精密吸取補陽還五湯藥液1 mL，搖勻，按含量測定項下供試品溶液的制備和測定法操作，分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣，測定補陽還五湯中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的峰面積。各色譜峰相對峰面積的RSD為2.34%，說明補陽還五湯樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗

精密吸取同一批補陽還五湯樣品溶液6份，各1 mL，按含量測定項下供試品溶液的制備和測定法操作，測定補陽還五湯中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的峰面積。各色譜峰相對峰面積的RSD為1.33%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收試驗

精密稱取已知補陽還五湯樣品溶液1 mL，共6份，精密加入毛蕊異黃酮葡萄糖苷、對照品按供試品制備方法制成供試液，測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量。毛蕊異黃酮葡萄糖苷的加樣回收率為101.15%，RSD為2.27%，說明該方法可用于毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測定。結(jié)果見表2。

表2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷加樣回收結(jié)果

2.2 補陽還五湯中黃芪藥材煎煮藥動學(xué)模型研究

2.2.1 煎煮藥動學(xué)的模型建立

根據(jù)查閱的文獻，以及Fick擴散定律及希格比傳質(zhì)穿透模型理論，推導(dǎo)出總方程[13-15]：

其中CB為溶液濃度，M為溶劑倍量，R為藥材充分吸收吸濕所需水體積與干的藥材質(zhì)量之比，σ1為藥材顆粒粒度，t為時間，n與擴散系數(shù)有關(guān)。

若只改變煎煮時間，對（1-1）取對數(shù)可得公式（1-2）：

若只改變?nèi)軇┍读?，對?-1）取對數(shù)可得公式（1-3）：

根據(jù)以上公式，通過合理地試驗設(shè)計，就可以初步建立補陽還五湯煎煮動力學(xué)模型。

2.2.2 補陽還五湯煎煮提取實驗

2.2.2.1 黃芪干藥材吸溶劑率的測定 分別取2、4、6、8、10、12 g黃芪，與同比例其他6味藥材，置于500 mL圓底燒瓶中，加入8倍量水，煎煮1 h，濾過稱重，結(jié)果見表 3，取平均值，R=3.25[16-22]。

表3 黃芪藥材干濕比

2.2.2.2 f1和σ1的測定根據(jù)“2.1.1”項下條件，對黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量進行測定，結(jié)果含量為0.25%確定f1為0.5783；采用均勻取樣的方法取黃芪20 g，分別測量其邊長，求均值，最終確定σ1為 2.10 cm。

2.2.2.3 提取時間對提取率的影響 采用上述建立的高效液相色譜法進行含量測定，結(jié)果見表4。通過試驗數(shù)據(jù)做lnCB-lnt線性回歸，考察煎煮出的毛蕊異黃酮葡萄糖苷濃度是否遵守（1-2）式，結(jié)果見圖4。由圖4可知，當M=8 mL/g時，線性回歸方程y=0.3692x-1.8699，R2=0.9795，根據(jù)方程，將相應(yīng)數(shù)值聯(lián)立可求得溶劑倍量為8 mL/g時，n=-0.3542，α=1.3706。

2.2.2.4 溶劑倍量對提取率的影響 采用上述建立的高效液相色譜法進行含量測定，對不同溶劑量提取的處方固定在30 min定點取樣，結(jié)果見表5。通過試驗數(shù)據(jù)做lnCB-lnt線性回歸，考察煎煮出的毛蕊異黃酮葡萄糖苷濃度是否遵守（1-3）式，結(jié)果見圖5。由圖5可知，t=30 min時，線性回歸方程y=0.9375x-6.4555，R2=0.9152，根據(jù)方程，將相應(yīng)數(shù)值聯(lián)立可求得提取時間為30 min時，n=0.8564，α=0.8679。

表4 不同時間補陽還五湯中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量

圖4 時間因素回歸方程

表5 不同溶劑倍量補陽還五湯中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量

圖 5 lnt-ln（M-R）考察因素

2.2.2.5 方程的建立 根據(jù)上述實驗推斷出煎煮藥動學(xué)方程為

2.2.3 模型的驗證

根據(jù)所建立的動力學(xué)方程式，可以計算出不同提取時間下補陽還五湯中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的濃度，計算結(jié)果見表6。

表6 模型的驗證結(jié)果（mg/mL）

以上檢驗數(shù)據(jù)表明，本研究所建立的動力學(xué)模型能較好地與試驗結(jié)果相吻合，各條件下的試驗數(shù)值與計算數(shù)值的標準偏差（0.3013%）基本能滿足工業(yè)標準偏差要求（<10%）。

3 討論

結(jié)果表明，補陽還五湯中黃芪藥材毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測定方法穩(wěn)定可行。推導(dǎo)出的提取動力學(xué)模型對補陽還五湯煎煮過程也有很好的適用性，但有一定的適用范圍，超過該范圍后預(yù)測誤差就會偏大。并且從lnCB-lnt圖中可以看出，補陽還五湯中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量隨著時間的增長而增加，所以實際煎煮過程中直接將黃芪浸泡后煎煮是符合本煎煮動力學(xué)模型的。實驗計算值與測量值有一定的誤差，可能是σ1、R測量誤差與儀器誤差造成的，有文獻將σ1并入α中從而減少誤差[23-24]，該模型的建立對于補陽還五湯的生產(chǎn)工藝考察具有一定指導(dǎo)意義。

國內(nèi)對于單味藥物煎煮動力學(xué)模型的建立研究比較多見，主要有以Fick擴散定律為基礎(chǔ)推算的煎煮動力學(xué)模型和計算K、α、β、AUC等動力學(xué)參數(shù)的煎煮動力學(xué)模型[25]。補陽還五湯中黃芪藥材煎煮動力學(xué)模型的建立，能為補陽還五湯煎煮時間、煎煮方式優(yōu)化改良及補陽還五湯中成藥的研制提供指導(dǎo)，可以闡明補陽還五湯中各藥物有效成分煎煮動力學(xué)間的差異，為研究補陽還五湯的配伍、補陽還五湯煎煮動力學(xué)以及相關(guān)的煎煮動力學(xué)研究奠定理論和實驗基礎(chǔ)。

本研究首次對復(fù)方中一味藥物進行煎煮動力學(xué)模型的建立，研究所建立的動力學(xué)模型能較好地與試驗結(jié)果相吻合，但是也只考慮了煎煮一次時的情況以及溶劑倍量、溫度不變的情況，這是本研究的局限性，今后應(yīng)該將多次提取、溶劑倍量、溫度因素結(jié)合到模型中，完善模型，最終用于指導(dǎo)補陽還五湯的工業(yè)生產(chǎn)。