女士保健酒功效成分含量阿魏酸測(cè)定研究

李 妍，梁慧珍，張長(zhǎng)霞，蘇 靜，陳 鵬，賈士儒

(1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457； 2.天士力控股集團(tuán)研究院健保食品開發(fā)中心，天津300410）

女士保健酒是由當(dāng)歸、人參、黃精、玉竹、枸杞子、大棗6味藥材滲漉而成的18%vol保健酒，具有美白祛斑、調(diào)經(jīng)止痛、補(bǔ)血活血、益氣安神之功效。其中當(dāng)歸中的阿魏酸（ferulic acid，F(xiàn)A），化學(xué)名為：4-羥基-3-甲氧基苯丙烯酸，是廣泛存在于當(dāng)歸、川芎、紅花等中藥材的有效成分之一[1]，常作為中藥成分及其制劑中定性定量的化學(xué)指標(biāo)用于評(píng)價(jià)和控制制劑的質(zhì)量[2]。藥理研究表明，阿魏酸具有抗氧化、抑制血栓的形成、增加冠脈流量、改善心肌缺血、抑制膠原和ADP誘導(dǎo)的血小板聚集作用。目前阿魏酸已成為臨床應(yīng)用的活血祛淤藥物之一[3]。當(dāng)歸中的阿魏酸在較低濃度下能顯著降低酪氨酸酶的單酚酶活力，也是一種強(qiáng)效的酪氨酸酶抑制劑[4]。5 mol/L的阿魏酸都可有效地抑制蝦血淋巴褐變，阿魏酸將蝦血淋巴中酪氨酸酶酶活抑制至5.97%[5]。在實(shí)際應(yīng)用中，發(fā)現(xiàn)阿魏酸水溶液放置一段時(shí)間后,在阿魏酸色譜峰旁出現(xiàn)一小峰[6-7]。后出現(xiàn)的峰很可能是阿魏酸的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。而且隨著時(shí)間的延長(zhǎng),轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的量越來(lái)越大,直至最后達(dá)到平衡。已有許多學(xué)者研究表明，阿魏酸的性質(zhì)不穩(wěn)定。賈曉斌等[8]研究表明，阿魏酸在溶液中不穩(wěn)定，其樣品溶液和對(duì)照品溶液均出現(xiàn)了不同程度的降解；康宇紅等[9]考察了pH值及溫度對(duì)阿魏酸鈉注射液穩(wěn)定性的影響，研究結(jié)果表明，其穩(wěn)定性受pH值和溫度影響較大；李行利等[10]的研究結(jié)果表明，阿魏酸的降解反應(yīng)屬于一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)，但是都沒有對(duì)這些現(xiàn)象進(jìn)行深入探討和給出合理的解釋。

穩(wěn)定性研究是保健酒研究與開發(fā)的一項(xiàng)重要內(nèi)容，是保證保健酒有效性和安全性的重要基礎(chǔ)。功效性成分若發(fā)生分解、變質(zhì)，不僅會(huì)影響其外觀，而且可引起有效成分的含量變化和效果的降低，導(dǎo)致保健酒失效，甚至產(chǎn)生或增加毒副作用，危及患者的健康和生命安全。

穩(wěn)定性試驗(yàn)的目的是考察女士保健酒在溫度、濕度、光線的影響下隨時(shí)間變化的規(guī)律，為保健酒的生產(chǎn)、包裝、貯存、運(yùn)輸條件提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)通過試驗(yàn)建立保健酒的有效期。

加速試驗(yàn)是指在保證不改變產(chǎn)品失效機(jī)理的前提下,通過強(qiáng)化試驗(yàn)條件,使受試產(chǎn)品加速失效,以便在較短時(shí)間內(nèi)獲得必要信息,來(lái)評(píng)估產(chǎn)品在正常條件下的可靠性或壽命指標(biāo)。通過加速試驗(yàn),可迅速查明產(chǎn)品的失效原因,快速評(píng)定產(chǎn)品的可靠性指標(biāo)。

為保證女士保健酒的質(zhì)量，本研究采用高效液相色譜法檢測(cè)保健酒中的阿魏酸，優(yōu)化檢測(cè)方法。并用加速試驗(yàn)考察3批女士保健酒中阿魏酸的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑（表1）

表1 實(shí)驗(yàn)所用試劑

枸杞子、玉竹和黃精，2017年購(gòu)于國(guó)藥樂仁堂河北藥業(yè)有限公司；林下山參，2016年購(gòu)于遼寧天士力森濤參茸股份有限公司；當(dāng)歸，2017年購(gòu)于甘肅漢草品匯中藥飲片有限公司；大棗，2017年購(gòu)于滄州銘鑫食品有限公司；食用酒精，2017年購(gòu)于吉林省新天龍實(shí)業(yè)股份有限公司。

經(jīng)檢驗(yàn)，枸杞子中的水分、總灰分、浸出物、枸杞多糖，玉竹中的水分、總灰分、浸出物、玉竹多糖，黃精中的水分、總灰分、浸出物、黃精多糖，林下山參中的水分、總灰分、人參Rg1、人參Re、人參Rb1，當(dāng)歸中的水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物、揮發(fā)油、阿魏酸，均符合《中國(guó)藥典》（2015年版第1部）的規(guī)定。

1.2 儀器與設(shè)備

色譜柱（Venusil MPC_18(2)），天津博納艾杰爾科技有限公司；KQ-250E型超聲波清洗器（KQ250），昆山市超聲儀器有限公司；安捷倫1260高效液相色譜儀（1260 InfinityII），美國(guó)安捷倫公司；Milli-Q超純水處理系統(tǒng)（Milli-QAdvantage），北京艾澤信科技有限公司密理博北京代理；XS105型十萬(wàn)分之一天平（XS105 DualRange），梅特勒-托利多儀器上海有限公司；生化培養(yǎng)箱（SPX-250BIII），天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 阿魏酸檢測(cè)

1.3.1.1 供試品溶液制備

取女士保健酒成品酒（批號(hào)：20170103）過0.45μm濾膜后備用。

1.3.1.2 對(duì)照品溶液制備

取阿魏酸對(duì)照品適量，精密稱定，置于棕色量瓶中，加70%甲醇制成12μg/mL的溶液，即得。

1.3.1.3 色譜條件[11]

色譜柱：Venusil MPC18(2)（4.60×250 mm，5μm），流動(dòng)相：乙腈-0.085%磷酸溶液（17∶83）；檢測(cè)波長(zhǎng)為316 nm；柱溫35℃，流速0.80 mL/min，進(jìn)樣量：10μL。

1.3.1.4 線形關(guān)系考察

分別精密吸取已配制好的濃度為0.036 mg/mL的對(duì)照品阿魏酸溶液0.10 mL、0.70 mL、1.40 mL、2.10 mL、2.80 mL、3.50 mL于5 mL容量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別進(jìn)樣10μL，記錄色譜圖和峰面積。以峰面積Y為縱坐標(biāo)，阿魏酸濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.1.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取同一批次女士保健酒，按照“1.3.1.1”制備供試品溶液1份，按照“1.3.1.3”方法，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄阿魏酸峰面積。

1.3.1.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密取吸女士保健酒樣品按照“1.3.1.1”制備供試品溶液和“1.3.1.2”的阿魏酸對(duì)照品溶液，按照“1.3.1.3”方法，分別于配制后的0、1.5 h、3 h、4.5 h、6 h、7.5 h進(jìn)行測(cè)定，記錄阿魏酸峰面積。

1.3.1.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批次女士保健酒，按照“1.3.1.1”制備供試品溶液6份，按照“1.3.1.3”方法測(cè)定并計(jì)算。

1.3.1.8 專屬性實(shí)驗(yàn)

阿魏酸專屬性樣品制備：女士保健酒的處方中不加入當(dāng)歸藥材制成的滲漉液為陰性對(duì)照。將陰性對(duì)照、按照“1.3.1.1”制備的女士保健酒供試品溶液及阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)溶液按照“1.3.1.3”方法色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。記錄液相色譜圖。

1.3.1.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取“1.3.1.5”同一女士保健酒樣品按照“1.3.1.1”制備供試品溶液5 mL 9份，置于10 mL容量瓶中，以“1.3.1.5”測(cè)得的阿魏酸平均含量值作為加入對(duì)照品含量的依據(jù)，約供試品中阿魏酸含量55.13%、110.25%、175.01%的對(duì)照品各3份分別對(duì)應(yīng)加供試品溶液，共9份，搖勻，按“1.3.1.3”方法測(cè)定，計(jì)算阿魏酸的含量和回收率。

1.3.2 阿魏酸的穩(wěn)定性

根據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版第2部附錄藥物制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則的有關(guān)要求,對(duì)女士保健酒中阿魏酸的穩(wěn)定性進(jìn)行試驗(yàn)研究。取一定數(shù)量按1.3.1.5方法測(cè)定同一女士保健酒樣品,置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱(溫差±1℃)內(nèi)3個(gè)月。每7天定時(shí)取樣,每次2支,混勻,依法測(cè)定含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿魏酸檢測(cè)

2.1.1 線性關(guān)系考察

按照“1.3.1.4”方法操作，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，阿魏酸濃度為橫坐標(biāo)，得線性回歸方程為Y=63989X-0.7676，R2=0.9999，結(jié)果表明，阿魏酸進(jìn)樣量在0.0072～0.25μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（見圖1）。

圖1 阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2 精密度

按照“1.3.1.5”操作，計(jì)算結(jié)果的6次進(jìn)樣峰面積RSD為1.02%，見表2。表明儀器精密度良好。

表2 精密度考察結(jié)果

2.1.3 穩(wěn)定性

按照“1.3.1.6”方法操作，發(fā)現(xiàn)女士保健酒中的阿魏酸在7.5 h內(nèi)穩(wěn)定，計(jì)算結(jié)果的阿魏酸峰面積RSD為1.49%，見表3。表明供試品溶液在7.5 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

表3 穩(wěn)定性考察結(jié)果

2.1.4 重復(fù)性

按照“1.3.1.7”方法操作，計(jì)算結(jié)果阿魏酸平均含量為0.006887 mg/mL，RSD為1.02%，見表4，表明本法重復(fù)性良好。

表4 重復(fù)性考察結(jié)果

2.1.5 專屬性

按照“1.3.1.8”方法操作，在陰性對(duì)照色譜圖中，阿魏酸保留時(shí)間處未檢測(cè)到色譜峰，表明方法專屬性良好，見圖2、圖3、圖4。

圖2 阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖

2.1.6 加標(biāo)回收率

按照“1.3.1.9”方法操作，計(jì)算結(jié)果見表5，平均回收率為102.38%，RSD為1.41%。說(shuō)明該方法滿足分析測(cè)定的要求。

圖3 女士保健酒供試品HPLC圖

圖4 阿魏酸專屬性HPLC圖

2.1.7 方法驗(yàn)證

取3批女士保健酒樣品按“1.3.1.1”方法制備供試品溶液，并在“1.3.1.3”色譜條件下測(cè)定供試品溶液，每份樣品進(jìn)樣2次，以平均峰面積計(jì)算阿魏酸含量，見表6。

表5 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6 保健酒中阿魏酸含量測(cè)定

2.2 阿魏酸的穩(wěn)定性（圖5）

由圖5可知，阿魏酸濃度在28 d內(nèi)緩慢下降，在28 d后急劇下降，在42 d后下降速率降低，直至56 d以后降至為零。由于女士保健酒中的阿魏酸在加速試驗(yàn)的3個(gè)月內(nèi)不穩(wěn)定，所以女士保健酒中的阿魏酸作為功效性指標(biāo)不能支持24個(gè)月的有效期。

圖5 阿魏酸穩(wěn)定性

3 討論

3.1 保健酒

保健酒穩(wěn)定性研究在保健酒質(zhì)量控制中是十分重要的，特別是含有不穩(wěn)定成分的保健酒容易受各種環(huán)境條件如溫度、光照和存放環(huán)境等因素影響發(fā)生降解或轉(zhuǎn)化，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)導(dǎo)致其質(zhì)量發(fā)生變化、功效性指標(biāo)效價(jià)降低。在保健酒有效成分中，不乏穩(wěn)定性較差的指標(biāo)成分，對(duì)這一類成分的分析對(duì)于保證和評(píng)價(jià)保健酒質(zhì)量具有十分重要的意義。

3.2 高效液相色譜法的建立

本研究建立了高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定阿魏酸及其降解產(chǎn)物的分析方法用于測(cè)定阿魏酸的含量，方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高。因此，本實(shí)驗(yàn)以這一方法來(lái)測(cè)定阿魏酸，為表征含有阿魏酸這一成分的保健酒提供手段，為更進(jìn)一步地研究阿魏酸的降解規(guī)律提供必要的數(shù)據(jù)支持。

根據(jù)女士保健酒多數(shù)藥材所含阿魏酸含量的特殊性，將檢測(cè)試驗(yàn)適度優(yōu)化。在藥典中指出檢測(cè)當(dāng)歸中阿魏酸的方法，但是沒有提到流動(dòng)相的流速和液相時(shí)長(zhǎng)。經(jīng)多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)女士保健酒中的阿魏酸采用0.8 mL/min的流速，使色譜中待測(cè)峰保留時(shí)間適中，峰形對(duì)稱，且與雜質(zhì)峰有較好的分離。在色譜圖中顯示，阿魏酸在22.5 min左右出峰并在30 min后沒有雜峰出現(xiàn)，所以檢測(cè)時(shí)間選擇30 min。

3.3 方法驗(yàn)證

根據(jù)阿魏酸藥理作用，選擇其作為一款具有美白祛斑、抗衰老類型的保健酒的指標(biāo)性成分，充分證明保健酒的抗衰老和抑制黑色素生長(zhǎng)的功效。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過色譜條件優(yōu)化建立了檢測(cè)保健酒中阿魏酸的HPLC檢測(cè)方法，并對(duì)3批保健酒酒樣進(jìn)行了檢測(cè)，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證該方法專屬性、精密度、重復(fù)性、加標(biāo)回收率、穩(wěn)定性等均符合要求，可作為保健酒中阿魏酸成分含量快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。

3.4 阿魏酸穩(wěn)定性的考察

保健酒研究中穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果以常溫穩(wěn)定試驗(yàn)的結(jié)果為準(zhǔn)。但是在常溫下考核試驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng)，不能及時(shí)掌握保健酒中功效性成分質(zhì)量變化的速度和規(guī)律，也不易及時(shí)發(fā)現(xiàn)和糾正影響保健酒中功效性成分質(zhì)量穩(wěn)定性的條件和因素。本研究采用的恒溫恒濕加速試驗(yàn)法研究女士保健酒中阿魏酸的貯藏穩(wěn)定性，在較短時(shí)間內(nèi)預(yù)測(cè)了女士保健酒中阿魏酸在常溫條件下的質(zhì)量穩(wěn)定性，大大縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

本研究以阿魏酸為代表對(duì)女士保健酒穩(wěn)定性進(jìn)行深入的研究，目前已有研究和文獻(xiàn)報(bào)道了阿魏酸不穩(wěn)定，然而在現(xiàn)有的質(zhì)量控制條件下常常作為保健品的主要有效成分或指標(biāo)成分之一，是因?yàn)樗哂锌寡趸⑶宄杂苫?、抑制血小板聚集和血栓形成等作用。通過研究明確了阿魏酸是否能作為女士保健酒的功效性指標(biāo)。由于在加速試驗(yàn)中，28 d后阿魏酸含量急劇下降，56 d后阿魏酸含量過低，因此說(shuō)明女士保健酒中的阿魏酸含量在常溫下不能維持2年的穩(wěn)定狀態(tài)。