無(wú)梗五加果黃酮的提取及其提取物的自由基清除活性比較

馮 穎， 赫子涵

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110866)

無(wú)梗五加(AcanthopanaxsessiliflorusSeem)別稱短梗五加，衛(wèi)生部于2008年第12號(hào)公告批準(zhǔn)其為新資源食品，是一種藥食同源的食品[1]。研究表明，無(wú)梗五加的果實(shí)具有降血脂[2]、抗腫瘤[3]、抗血小板[4-5]、清除自由基、耐缺氧、抗疲勞等作用[6-8]。近些年來(lái)，國(guó)內(nèi)外不斷有將無(wú)梗五加果制成果汁、果酒、果干等的報(bào)道[9]，其作為新型營(yíng)養(yǎng)健康食品也受到越來(lái)越多的關(guān)注。已有研究表明，無(wú)梗五加果的主要活性成分包括黃酮、皂苷、香豆素、三萜、酚酸、多糖等[6，10-11]，其中黃酮類化合物是研究的熱點(diǎn)。安琪研究了無(wú)梗五加果中總黃酮含量的測(cè)定方法[10]。李春芳等建立了無(wú)梗五加果提取物中總黃酮含量及金絲桃苷含量的測(cè)定方法[12]。李林在對(duì)無(wú)梗五加果實(shí)化學(xué)成分的研究中，以金絲桃苷及東莨菪內(nèi)酯為指標(biāo)，建立了無(wú)梗五加果的質(zhì)量控制方法[13]。筆者所在課題組通過前期試驗(yàn)，建立了無(wú)梗五加果中黃酮類化合物含量的測(cè)定方法、乙醇回流提取及大孔樹脂純化工藝參數(shù)，并通過烘箱高溫誘導(dǎo)法、化學(xué)發(fā)光法及濾紙片法測(cè)定表明，無(wú)梗五加果黃酮類化合物具有抗油脂氧化、清除羥自由基和超氧自由基的能力，并具有一定的抑菌活性[8，14]。本研究在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用超聲波法提取無(wú)梗五加果黃酮類化合物，用響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝參數(shù)，以提高其提取效率和提取量，并對(duì)提取物的各種自由基的清除活性進(jìn)行測(cè)定和比較，旨在促進(jìn)無(wú)梗五加果黃酮類化合物在食品及保健品領(lǐng)域的應(yīng)用步伐。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

無(wú)梗五加干果，購(gòu)自遼寧省丹東農(nóng)業(yè)科學(xué)院。蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品、金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)，均購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、鄰苯三酚、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫等均為分析純；甲醇、乙腈為色譜純。

高速中藥粉碎機(jī)，浙江省溫嶺市創(chuàng)力藥材器械廠；電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；KQ-250A型超聲反應(yīng)器，昆山市超聲儀器有限公司；UV-1600型紫外可見分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器公司；高效液相色譜，日本島津公司；微量移液器，上海求精生化試劑儀器有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海博通經(jīng)貿(mào)有限公司；SHZ-ⅢB型循環(huán)水真空泵，上?；茖W(xué)儀器有限公司；LG0.2型真空冷凍干燥機(jī)，新陽(yáng)速凍設(shè)備制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 無(wú)梗五加果黃酮類化合物的提取工藝

1.2.1.1 單因素試驗(yàn) 將無(wú)梗五加果干燥果實(shí)粉碎，過40目篩，準(zhǔn)確稱取1 g無(wú)梗五加果粉末，置于100 mL三角瓶中，加入不同體積、一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，用玻璃紙密封好后置于超聲波反應(yīng)器中，在超聲功率250 W、室溫(設(shè)定為 25 ℃)下超聲提取一定時(shí)間。待超聲處理完畢后，真空過濾取濾液，用相應(yīng)提取溶劑定容至100 mL。取適量體積的溶液，測(cè)定其中黃酮類化合物含量。

1.2.1.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙醇濃度、超聲提取時(shí)間、提取劑用量為自變量，采用Design Expert 8.0軟件中的中心組合(Box-Behnken)試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)。采用Design Expert 8.0軟件中的響應(yīng)優(yōu)化器進(jìn)行優(yōu)化分析，得到回歸模型和優(yōu)化的工藝參數(shù)。

1.2.2 黃酮類化合物含量的測(cè)定方法[14]用移液管吸取1.0 mL 樣品溶液于10 mL試管中，加入0.3 mL 5% NaNO2溶液，混勻后，靜置6 min，再加入0.3 mL 10% Al(NO3)3，搖勻后放置6 min。加入4.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的NaOH溶液，用濃度為30%的乙醇定容，搖勻，放置10 min。用紫外-可見分光光度計(jì)在500 nm處測(cè)定吸光度。同時(shí)以不加樣品液的試劑作為空白參比液。將吸光度值代入以蕓香苷為標(biāo)準(zhǔn)品制作的回歸方程中，計(jì)算黃酮的含量。

表1 試驗(yàn)因素水平及編碼值

1.2.3 高效液相色譜分析條件 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制：用甲醇水溶液(甲醇、水的體積比為1 ∶1)溶解配制成金絲桃苷、蕓香苷、槲皮素濃度分別為0.046、0.057、0.051 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

樣品溶液的配制：將超聲提取得到的無(wú)梗五加果黃酮提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮后凍干，用甲醇水溶液(甲醇、水的體積比為 1 ∶1)配制成濃度為1.3 mg/mL的樣品溶液，混合均勻即得待測(cè)樣品溶液。

將上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液與樣品溶液分別過0.4 μm濾膜，進(jìn)樣后依據(jù)保留時(shí)間定性，確定無(wú)梗五加果黃酮類化合物組成。高效液相色譜條件：色譜柱為Agilent TC-C18，柱溫為25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm，進(jìn)樣量為10 μL。梯度程序設(shè)定見表2。

表2 液相梯度條件

1.2.4 自由基清除活性的測(cè)定 將超聲提取得到的無(wú)梗五加果黃酮提取液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮后凍干，用50%乙醇配制成不同濃度的樣品溶液，進(jìn)行自由基清除活性的測(cè)定。

1.2.4.1 DPPH自由基清除活性的測(cè)定[15]取3.3 mL樣品溶液，加入配制好的0.5 mL濃度為1.0×10-5mol/L的DPPH無(wú)水乙醇溶液，搖勻，室溫避光反應(yīng)30 min后于520 nm測(cè)定吸光度。自由基清除率計(jì)算公式如下：

清除率=[1-(Ds-Db)/Dc]×100%。

式中：Dc為對(duì)照吸光度；Ds為樣品吸光度；Db為樣品空白吸光度。

樣品活性的測(cè)定：將1 mL樣品溶液、3.2 mL蒸餾水、4.5 mL pH值為8.2的50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液混勻，然后按照上述相同的方法測(cè)定325 nm處的吸光度。自由基清除率計(jì)算公式如下：

清除率=(Dc-Ds)/Dc×100%。

式中：Dc為加入樣品前的吸光度；Ds為加入樣品5 min后的吸光度。

1.2.4.3 羥自由基(·OH)清除活性的測(cè)定[17]取濃度為60 mmol/L的FeSO4溶液、水楊酸-乙醇溶液各2 mL，搖勻混合，加入1.0 mL樣品溶液，加蒸餾水定容至20 mL，加入2 mL 6 mmol/L H2O2，反應(yīng)10 min，在520 nm處測(cè)定吸光度。自由基清除率計(jì)算公式如下：

[1-(Ds-Db)/Dc]×100%。

式中：Dc為對(duì)照吸光度；Ds為樣品吸光度；Db為樣品空白吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波法提取無(wú)梗五加果黃酮單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對(duì)黃酮提取的影響 從圖1中可看出，隨著乙醇濃度的升高，黃酮提取量增加，當(dāng)乙醇濃度為30%時(shí)，提取量達(dá)到最大值；隨著乙醇濃度繼續(xù)增加，水溶性黃酮溶解性降低，黃酮提取量隨之下降。

2.1.2 超聲提取時(shí)間對(duì)黃酮提取的影響 從圖2可以看出，隨著提取時(shí)間的增加，黃酮提取量逐漸增加，在40 min時(shí)達(dá)到最大值；隨著提取時(shí)間繼續(xù)增加，提取量反而下降，原因可能是提取出的黃酮在超聲波的作用下被逐漸分解。

2.1.3 提取劑用量對(duì)黃酮提取的影響 從圖3可以看出，隨著提取劑用量的不斷增加，黃酮的提取量也不斷增加，當(dāng)提取劑用量為50 mL/g時(shí)，黃酮提取量達(dá)到最大值；隨著提取劑用量繼續(xù)增加，黃酮提取量有所下降，當(dāng)提取劑用量在50～90 mL/g 范圍內(nèi)時(shí)，提取量較高。

2.2 超聲波法提取無(wú)梗五加果黃酮響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

將表3試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，得到回歸方程如下：Y=40.85+0.59A+2.40B-9.32C-0.99AB-0.15AC-1.43BC-3.19A2-1.77B2+2.15C2。

表3 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表4方差分析及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，該回歸方程模型影響極顯著(P<0.000 1)，回歸模型的R2=0.984 6，說(shuō)明該模型能夠解釋98.46%的變化，回歸方程失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著(P=0.064 5>0.05)，說(shuō)明所得回歸方程有較好的準(zhǔn)確度和可靠性，擬合度良好，可用該模型分析和預(yù)測(cè)無(wú)梗五加果黃酮超聲提取的結(jié)果?；貧w方程系數(shù)的顯著性分析結(jié)果表明，各因素對(duì)黃酮提取量的影響程度排序?yàn)樘崛┯昧?超聲提取時(shí)間>乙醇濃度(C>B>A)，方程的一次項(xiàng)提取時(shí)間(B)、料液比(C)對(duì)響應(yīng)值的影響極顯著；二次項(xiàng)A2對(duì)總黃酮含量的影響極顯著，二次項(xiàng)B2、C2對(duì)響應(yīng)值的影響顯著。綜上所述，單個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)黃酮提取量的影響并非只是線性關(guān)系。

2.3 超聲波法提取無(wú)梗五加果黃酮響應(yīng)曲面圖與等高線圖分析

由圖4可知，隨乙醇濃度的不斷增大，黃酮提取量先增高后下降(圖4-a、圖4-b)；而當(dāng)提取劑用量不斷增加時(shí)，黃酮提取量不斷下降(圖4-b、圖4-c)； 黃酮提取量隨著超聲提取時(shí)間的不斷增加，則呈現(xiàn)先增加后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)(圖 4-a、圖4-c)。由此可見，各因素之間沒有明顯的交互作用。如果某個(gè)響應(yīng)曲面坡度非常陡峭，則表明響應(yīng)值對(duì)于處理?xiàng)l件的改變非常敏感[14]。從響應(yīng)曲面坡度來(lái)看，黃酮提取量對(duì)于提取劑用量的改變最敏感，其次是超聲提取時(shí)間，而黃酮提取量對(duì)乙醇濃度的改變不敏感，與表4回歸模型方差分析結(jié)果一致。

表4 回歸模型方差分析

注：“*”表示在0.05水平影響顯著；“**”表示在0.01水平影響顯著。

利用響應(yīng)面分析得到最佳提取工藝預(yù)測(cè)值，即乙醇濃度為29.21%，提取時(shí)間為40 min，料液比為1 g ∶50 mL，此時(shí)黃酮提取量理論值可達(dá)54.37 mg/g。將此提取工藝運(yùn)用到實(shí)際操作當(dāng)中，優(yōu)化參數(shù)，即提取濃度為30%，提取時(shí)間為 40 min，料液比為1 g ∶50 mL，時(shí)，實(shí)際的黃酮提取量為 54.21 mg/g，達(dá)到預(yù)期值的99.71%。

2.4 無(wú)梗五加果黃酮提取物組成的高效液相色譜分析

本試驗(yàn)采用梯度洗脫條件對(duì)無(wú)梗五加果黃酮組分進(jìn)行了分離。圖5顯示，標(biāo)準(zhǔn)品蕓香苷、金絲桃苷、槲皮素的出峰保留時(shí)間分別為26.602、27.343、42.873 min。由圖6可以看出，樣品在保留時(shí)間分別為26.704、27.450、42.977 min處出峰，與標(biāo)準(zhǔn)品蕓香苷、槲皮素、金絲桃苷出峰時(shí)間基本一致。馮勝等采用單一成分測(cè)定的高效液相色譜法分別對(duì)無(wú)梗五加果中的蕓香苷、槲皮素和金絲桃苷含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明，無(wú)梗五加果中含有金絲桃苷、蕓香苷、槲皮素，但后兩者的含量較低[18]， 從本試驗(yàn)的液相色譜圖出峰結(jié)果看， 與其研究結(jié)果相同。

2.5 無(wú)梗五加果黃酮提取物的自由基清除活性的測(cè)定和比較

由圖7可以看出，在所考察濃度范圍內(nèi)，無(wú)梗五加果黃酮提取物對(duì)羥自由基的清除活性最強(qiáng)，對(duì)DPPH自由基的清除活性則隨其濃度增加而明顯增強(qiáng)，當(dāng)濃度較低時(shí)，其自由基清除活性為三者中最弱的，但當(dāng)濃度接近0.4 mg/mL時(shí)，其自由基清除活性已超過對(duì)超氧陰離子自由基的清除活性。

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)無(wú)梗五加果黃酮類化合物超聲波提取工藝進(jìn)行了參數(shù)的優(yōu)化，并結(jié)合實(shí)際試驗(yàn)操作條件，最終確定最優(yōu)的操作工藝參數(shù)為乙醇濃度30%，料液比1 g ∶50 mL，提取時(shí)間40 min，實(shí)際提取量為54.21 mg/g，達(dá)到預(yù)期值的99.71%。

對(duì)于提取后的無(wú)梗五加果黃酮提取物，通過與標(biāo)準(zhǔn)品(對(duì)照)保留時(shí)間進(jìn)行比較，利用高效液相色譜法進(jìn)行定性分析，確定其黃酮類組成包括蕓香苷、金絲桃苷、槲皮素。

在所考察濃度范圍內(nèi)(0.05～0.4 mg/mL)，無(wú)梗五加果黃酮提取物對(duì)羥基自由基的清除活性最強(qiáng)，對(duì)DPPH自由基的清除活性隨濃度增加而增強(qiáng)的趨勢(shì)最為明顯。