湖北麥冬葉片碳代謝對(duì)土壤干旱的響應(yīng)

孫永林， 湯尚文， 徐 馨， 柯亞婕， 王啟會(huì)

(湖北文理學(xué)院化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院，湖北襄陽(yáng) 441053)

在全球氣候變暖的背景下，干旱已成為限制作物生長(zhǎng)和產(chǎn)量最重要的生態(tài)因子。據(jù)全球氣候評(píng)估權(quán)威組織-機(jī)構(gòu)——政府間氣候變化委員會(huì)(IPCC)報(bào)道，到21世紀(jì)末，地球表面溫度將會(huì)升高1.1～6.4 ℃[1]。隨著氣候變暖的發(fā)展，水分蒸發(fā)量將會(huì)進(jìn)一步加大，水分虧缺將會(huì)加劇，干旱發(fā)生的頻率和強(qiáng)度也會(huì)增加，持續(xù)的時(shí)間也會(huì)更長(zhǎng)[2]。干旱主要通過(guò)降低植物的吸水能力從而影響植物的生長(zhǎng)，而低水分供應(yīng)下植物生長(zhǎng)受限主要是因?yàn)樘即x受阻。碳代謝是植物生命活動(dòng)的中心，植物要想長(zhǎng)期存活需要同化足夠多的碳來(lái)構(gòu)建生物量。植物體內(nèi)的碳可分為兩大類(lèi)，一類(lèi)是以纖維素、木質(zhì)素等為代表的用來(lái)進(jìn)行形態(tài)建成的結(jié)構(gòu)性碳，另一類(lèi)是以可溶性糖和淀粉為代表的非結(jié)構(gòu)性碳，非結(jié)構(gòu)性碳可在植物遭受環(huán)境脅迫時(shí)起階段性緩沖作用[3]。以往研究表明，在輕度和中度水分虧缺下，碳代謝主要受氣孔關(guān)閉的限制，氣孔關(guān)閉降低了胞間二氧化碳的濃度，導(dǎo)致二氧化碳擴(kuò)散到羧化位點(diǎn)的速率降低。隨著干旱程度的進(jìn)一步加劇或干旱持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)，光合酶活力降低、細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞等代謝損傷就會(huì)發(fā)生，在這種情況下，非結(jié)構(gòu)性碳將會(huì)更多地分配給可溶性糖、脯氨酸、甜菜堿等富含碳元素的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓[4-8]。

湖北麥冬[LiriopeSpicata(Thunb.) Lour. var.proliferaY. T. Ma]是百合科山麥冬屬藥食兩用植物，塊根質(zhì)地柔韌，味甘，含有多糖、皂苷、黃酮等人體所需的營(yíng)養(yǎng)成分，具有滋陰生津、潤(rùn)肺止咳等功效，是襄陽(yáng)大宗道地藥材，產(chǎn)量高于川、杭麥冬[9]。襄陽(yáng)地處鄂西北，是湖北季節(jié)性干旱易發(fā)地區(qū)，從2010—2016年，旱情逐漸加重，重旱、特重旱頻發(fā)，且大旱年出現(xiàn)的頻率呈增加趨勢(shì)，農(nóng)作物欠收甚至絕收，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的影響。對(duì)湖北麥冬這種中藥材而言，前人對(duì)其生藥學(xué)特性進(jìn)行了大量研究[10-13]，但對(duì)在持續(xù)干旱條件下碳代謝的研究尚未涉及。本試驗(yàn)采用生物化學(xué)的方法，對(duì)生長(zhǎng)在持續(xù)干旱條件下的盆栽湖北麥冬葉片中與碳代謝相關(guān)的光合色素及關(guān)鍵酶活力進(jìn)行了分析，同時(shí)測(cè)定了非結(jié)構(gòu)性碳(可溶性糖、淀粉和脯氨酸)的含量，從而揭示持續(xù)干旱條件下湖北麥冬的抗旱機(jī)制，為其規(guī)?；N植提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

盆栽試驗(yàn)在湖北文理學(xué)院鄂西北植物研究所內(nèi)進(jìn)行。2015年3月初，從襄陽(yáng)市歐廟鎮(zhèn)麥冬種植基地選取長(zhǎng)勢(shì)基本一致、生長(zhǎng)狀況良好的一年生麥冬苗，單株移栽于規(guī)格相同的塑料桶(口徑27.5 cm、底徑22 cm、高31 cm，容積約為19 L)內(nèi)，桶內(nèi)裝當(dāng)?shù)攸S棕壤土8 kg，土壤田間持水量為36.60%。先正常供水4周以保證移栽后的麥冬苗正常生長(zhǎng)，4月1日停止?jié)菜?，?duì)照組正常供水，每隔10 d收樣1次，共收樣3次(0、10、20 d)。每次收樣各處理各收5個(gè)重復(fù)，樣品置于 -80 ℃ 超低溫冰箱用于生理指標(biāo)的測(cè)定。試驗(yàn)期間，晴天露天培養(yǎng)，陰雨天則置于遮雨棚內(nèi)。

1.2 測(cè)定指標(biāo)

1.2.1 葉相對(duì)含水量 參照Galle等的方法[14]測(cè)定麥冬葉相對(duì)水分含量(relative water content，RWC)。選擇長(zhǎng)勢(shì)良好、大小基本一致的5株麥冬，取發(fā)育完全的葉片5片，分別稱其鮮質(zhì)量(FW)，然后將葉浸沒(méi)于蒸餾水中，置于4 ℃下至飽和狀態(tài)后取出，擦干表面水分測(cè)其飽和鮮質(zhì)量(TW)，再將葉片在鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)80 ℃下烘干至恒質(zhì)量(DW)。按照下列公式計(jì)算出RWC：

RW=(FW-DW)/(TW-DW)×100%。

1.2.2 光合色素的含量 光合色素的提取采用高俊鳳的方法[15]。準(zhǔn)確稱取30 mg葉片，研磨成勻漿后，加入80%的丙酮1.9 mL，暗中提取24 h，室溫條件下離心10 min(15 000 r/min)。取上清液0.5 mL，加入80%丙酮2 mL，在波長(zhǎng)為663、645、470 nm處測(cè)吸光度，測(cè)得葉綠素a、葉綠素b和類(lèi)胡蘿卜素含量，葉綠素a與葉綠素b之和即為葉綠素總量，同時(shí)測(cè)得葉綠素a和葉綠素b的比值。空白對(duì)照為80%的丙酮。

1.2.3 核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)活力測(cè)定 核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶活力測(cè)定參照Dewir等的方法[16]略有改動(dòng)。稱取鮮葉300 mg在液氮中研磨成粉末狀，加入1 mL預(yù)冷的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH值 7.5，內(nèi)含16 mg PVP、1 mmol/L二硫蘇糖醇、0.2 mmol/L EDTA·Na2、5 mmol/L巰基乙醇、10 μL Triton、2 mmol/L MgCl·6H2O和5 mmol/L NaHCO3)，4 ℃下離心20 min(15 000 r/min)，上清液即為粗酶液。反應(yīng)體系包括 100 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH值8.0)、20 mmol/L NaHCO3、5 mmol/L MgCl·6H2O、3.5 mmol/L ATP、3.5 mmol/L 磷酸肌酸、0.4 mmol/L NADH、0.24 U/μL磷酸肌酸激酶、0.24 U/μL 3-磷酸甘油醛脫氫酶、0.24 U/μL 3-磷酸甘油酸激酶、0.5 mmol/L RUBP，用100 μL粗酶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，28 ℃下測(cè)定在340 nm波長(zhǎng)下吸光度的變化，共測(cè)3 min，以1 min酶活力變化0.01為1個(gè)酶活單位(U)。

1.2.4 可溶性糖含量 可溶性糖含量的測(cè)定采用蒽酮-H2SO4比色法[17]。

1.2.5 淀粉含量 淀粉含量的測(cè)定采用高俊鳳的方法[15]。準(zhǔn)確稱取葉片30 mg，用80%乙醇溶液1.5 mL在80 ℃水浴條件下提取30 min，冷卻至室溫后，4 ℃下離心20 min(15 000 r/min)，棄去上清液，往沉淀中再加入80%乙醇溶液1.5 mL，按照同樣的方法再提取2次，留沉淀。往沉淀中加入蒸餾水0.4 mL，沸水浴1 h，冷卻至室溫后，往其中加入9.2 mol/L HClO4，攪拌15 min，再加蒸餾水0.8 mL，混勻后，15 000 r/min離心10 min，取上清液500 μL，加蒽酮-H2SO4溶液2 mL，沸水浴10 min，冷卻至室溫后，在620 nm處測(cè)定吸光度。

1.2.6 脯氨酸含量 脯氨酸含量的測(cè)定采用磺基水楊酸法[15]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)采用Excel軟件計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，用SPSS 17.0分析不同水分處理之間的差異顯著性(P<0.05)，并用Origin 8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱對(duì)湖北麥冬葉片相對(duì)水分含量的影響

RWC是表征植物組織水分狀況的重要指標(biāo)。由圖1可知，在正常水分條件下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，葉片RWC無(wú)顯著性變化。但在干旱條件下，隨干旱持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)，葉片RWC顯著降低(P<0.05)，與對(duì)照相比，當(dāng)干旱持續(xù)10 d時(shí)，RWC含量降低了6.4%，而當(dāng)干旱持續(xù)20 d時(shí)，RWC含量降低了14%，表明土壤中的水分狀況直接影響植物葉肉組織內(nèi)的水分分布，可能因?yàn)橥寥栏珊蛋l(fā)生后，植物根系的吸水能力減弱，通過(guò)質(zhì)外體和共質(zhì)體途徑運(yùn)輸?shù)饺~片中的水分也會(huì)相應(yīng)減少，干旱持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)，這種影響越顯著。

2.2 干旱對(duì)湖北麥冬葉片光合色素的影響

光合色素是植物吸收光能進(jìn)行光合作用的重要物質(zhì)，主要包括葉綠素a、葉綠素b和類(lèi)胡蘿卜素，主要參與光能的吸收、傳遞并引起原初光化學(xué)反應(yīng)。由表1可知，在正常水分條件下，3類(lèi)色素的含量均有增加，但并不顯著。在干旱10 d時(shí)，與對(duì)照相比，葉綠素a、葉綠素b和類(lèi)胡蘿卜素含量均顯著降低(P<0.05)，在持續(xù)干旱20 d時(shí)，降幅更大。但持續(xù)干旱10 d和20 d時(shí)，葉綠素b、類(lèi)胡蘿卜素和總?cè)~綠素含量無(wú)顯著差異。另外，葉綠素a含量與葉綠素b含量比值(葉綠素a/b)為3左右。表明持續(xù)干旱對(duì)光合色素的含量有顯著影響，但相比之下對(duì)葉綠素a的影響較為顯著。

表1 干旱對(duì)湖北麥冬光合色素的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。

2.3 干旱對(duì)湖北麥冬葉片核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶活力的影響

核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)是光合碳同化過(guò)程中卡爾文循環(huán)里催化羧化反應(yīng)的關(guān)鍵酶，進(jìn)入葉綠體的CO2與其受體核酮糖-1，5-二磷酸在Rubisco的催化下生成3-磷酸甘油酸，CO2得以固定，從而實(shí)現(xiàn)了無(wú)機(jī)物向有機(jī)物的轉(zhuǎn)化[18]。由圖2可知，在正常水分供應(yīng)的條件下，隨發(fā)育時(shí)間的延長(zhǎng)，Rubisco活力顯著增強(qiáng)并趨于穩(wěn)定。當(dāng)土壤干旱持續(xù)10 d時(shí)，受旱植株的Rubisco活力與對(duì)照相比無(wú)顯著性變化，但隨著干旱時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，當(dāng)持續(xù)干旱20 d時(shí)，受旱植株的Rubisco活力顯著降低(P<0.05)。表明一定程度的土壤干旱對(duì)植物的羧化反應(yīng)并無(wú)顯著性影響，而持續(xù)干旱則嚴(yán)重降低Rubisco催化能力，從而影響著植物的光合碳固定。

2.4 干旱對(duì)湖北麥冬葉片可溶性糖含量的影響

土壤干旱可導(dǎo)致植物遭受滲透脅迫，在一定的脅迫范圍內(nèi)，植物可通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)累積無(wú)機(jī)離子或有機(jī)溶質(zhì)進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)以維持細(xì)胞的膨壓?？扇苄蕴鞘侵匾挠袡C(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞壓力勢(shì)的維持起重要調(diào)節(jié)作用[19]。由圖3可知，在正常水分條件下，湖北麥冬葉片內(nèi)可溶性糖含量無(wú)顯著性變化。當(dāng)遭受10 d的干旱脅迫時(shí)，與對(duì)照相比，受旱植株葉片內(nèi)可溶性糖含量顯著升高(P<0.05)，而當(dāng)干旱持續(xù)到 20 d 時(shí)，可溶性糖含量則顯著降低(P<0.05)。表明在干旱條件下，湖北麥冬可通過(guò)在葉肉細(xì)胞內(nèi)累積可溶性糖以調(diào)節(jié)滲透勢(shì)，從而抵抗干旱脅迫。而當(dāng)持續(xù)干旱進(jìn)行到一定程度后，植物的滲透調(diào)節(jié)能力受限，從而表現(xiàn)為參與滲透調(diào)節(jié)的物質(zhì)含量顯著降低。

2.5 干旱對(duì)湖北麥冬葉片淀粉含量的影響

可溶性糖和淀粉是植物在葉綠體中經(jīng)光合碳同化合成的2種重要的非結(jié)構(gòu)性碳水化合物，在一定條件下，植物體可發(fā)生同化物的再分配和再利用。在逆境條件下，淀粉可通過(guò)水解作用轉(zhuǎn)化為蔗糖、葡萄糖等可溶性糖進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)[3]。由圖 4可知，在正常供水條件下，淀粉含量無(wú)顯著性變化，隨著發(fā)育時(shí)間的延長(zhǎng)，則呈顯著增加趨勢(shì)。持續(xù)干旱對(duì)淀粉含量的影響較為明顯，當(dāng)干旱持續(xù)10 d時(shí)，與對(duì)照相比，淀粉含量顯著降低(P<0.05)，當(dāng)干旱持續(xù)20 d時(shí)，淀粉含量則進(jìn)一步降低。表明干旱可引起非結(jié)構(gòu)性碳水化合物的再分配，干旱條件下分配給用于淀粉合成的碳減少，而分配給可溶性糖的碳增多，從而緩沖了干旱脅迫對(duì)湖北麥冬葉片造成的傷害。

2.6 干旱對(duì)湖北麥冬葉片脯氨酸含量的影響

脯氨酸是植物蛋白質(zhì)的重要組分，在正常狀態(tài)下，脯氨酸的含量很低，但在逆境條件下游離脯氨酸會(huì)大量累積[18]。由圖 5可知，在正常水分條件下，葉片內(nèi)脯氨酸含量隨發(fā)育進(jìn)程的延續(xù)無(wú)顯著性波動(dòng)。但當(dāng)干旱進(jìn)行10 d時(shí)，與對(duì)照相比，脯氨酸含量顯著增加(P<0.05)，而當(dāng)干旱持續(xù)20 d時(shí)，脯氨酸含量顯著增加(P<0.05)，但增幅減小。表明在干旱條件下，植物在細(xì)胞內(nèi)累積較多的脯氨酸以增強(qiáng)滲透調(diào)節(jié)能力，但干旱持續(xù)到一定程度時(shí)植物體內(nèi)脯氨酸的累積量減少，滲透調(diào)節(jié)能力減弱。脯氨酸累積還可能降低干旱期間蛋白質(zhì)大量水解產(chǎn)生的游離氨對(duì)植物的毒害，貯存氮源和碳源，為逆境解除后恢復(fù)生長(zhǎng)提供能源。

3 討論與結(jié)論

代謝是植物最基本的生命活動(dòng)過(guò)程，碳代謝在植株體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化直接影響著光合產(chǎn)物的形成、轉(zhuǎn)化以及產(chǎn)量的形成[20]。光合作用是植物最基本的生理過(guò)程之一，也是碳代謝的一個(gè)重要組成部分[21]。葉片中葉綠素含量和Rubisco 活性直接影響植物的光合固碳能力。植物通過(guò)根系從土壤中吸收水分，利用光能將水和二氧化碳同化形成碳水化合物，而水分不僅是碳代謝的原料，而且也是酶發(fā)揮催化效能的媒介物質(zhì)，因此，土壤水分的供應(yīng)狀態(tài)直接影響植物的光合碳代謝能力。在本研究中，隨著干旱持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)，葉片中RWC含量顯著降低，葉綠素的合成速度減慢，從而導(dǎo)致光合色素含量的降低，再加上Rubisco活力顯著降低，因此嚴(yán)重影響湖北麥冬的光合碳固定能力。以往研究表明，輕度干旱對(duì)水稻Rubisco活力無(wú)顯著性影響，重度干旱則抑制Rubisco活力從而導(dǎo)致光合速率下降[22]。Majumdar 等以大豆為試驗(yàn)材料研究干旱脅迫對(duì)Rubisco活力的影響，發(fā)現(xiàn)Rubisco活力在短期干旱脅迫的早期急劇下降，暗示Rubisco活力對(duì)水分脅迫比較敏感[23]。本研究也得出類(lèi)似的結(jié)果，表明土壤干旱通過(guò)影響碳代謝過(guò)程中的光合色素及光合酶活力等因素，進(jìn)而影響著植物對(duì)二氧化碳的羧化和固定能力，而且干旱程度越深，影響越顯著。

非結(jié)構(gòu)性碳水化合物(主要包括可溶性糖和淀粉)是植物碳代謝的重要產(chǎn)物，其含量變化不僅能反映植物體內(nèi)的生理狀況，而且還能在植物遭受環(huán)境脅迫時(shí)起一定的緩沖作用[3]。當(dāng)植物處在逆境條件下通過(guò)光合碳固定制造的有機(jī)碳水化合物的量不能滿足代謝的需求時(shí)，只能對(duì)有限的碳水化合物進(jìn)行重新分配和利用以提高其利用效率，從而保證在逆境條件下的生長(zhǎng)發(fā)育[19]。而重新分配和利用的途徑之一便是合成較多的如可溶性糖、脯氨酸等富碳化合物，從而增加細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)的濃度以調(diào)節(jié)滲透壓[18]。在本研究中，在干旱脅迫下，湖北麥冬葉片內(nèi)非結(jié)構(gòu)性碳之間相互轉(zhuǎn)化，在干旱持續(xù)10 d時(shí)，淀粉含量顯著降低，而可溶性糖含量顯著升高，暗示湖北麥冬在光合酶活力降低的情況下對(duì)葉片內(nèi)的碳水化合物進(jìn)行了重新分配。而可溶性糖含量的升高可增強(qiáng)細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力，除此以外，富碳分子脯氨酸的含量也顯著升高，滲透調(diào)節(jié)能力進(jìn)一步增強(qiáng)。但干旱持續(xù)到一定時(shí)間后，湖北麥冬葉片內(nèi)非結(jié)構(gòu)性碳及脯氨酸含量均顯著降低，表明滲透調(diào)節(jié)能力具有一定的局限性，與干旱脅迫持續(xù)的時(shí)間及脅迫強(qiáng)度密切相關(guān)。

因此，干旱對(duì)湖北麥冬葉片內(nèi)的碳代謝有著顯著的影響，在干旱持續(xù)10 d時(shí)，光合色素含量、Rubisco活力降低，暗示光合碳固定能力降低。在此情況下，湖北麥冬對(duì)葉片內(nèi)有限的碳水化合物進(jìn)行了重新分配和利用，將有限的碳更多地分配給可溶性糖和脯氨酸等富碳分子，以提高細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力，從而抵御干旱脅迫。但隨著干旱時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，碳代謝及滲透調(diào)節(jié)能力均降低。