彝良小草壩烏天麻對(duì)東莨菪堿所致記憶障礙模型小鼠的影響及機(jī)制研究

季宇彬，董婉睿,，劉雪松,，王 敏，丁世蘭，杜玉洋，楊勇述，徐萬(wàn)雷，劉朝斌，李才汪，孫桂波，孫曉波

(1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所藥理毒理中心，北京 100193；3. 云南省彝良縣天麻產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)辦公室，云南 昭通 657600)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)又稱老年性癡呆，是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性的認(rèn)知功能減退或障礙[1]。隨著人口老齡化傾向，該病發(fā)病率有增高趨勢(shì)，嚴(yán)重影響了人類的身心健康及生活質(zhì)量。

天麻(GastrodiaelataBl.)為蘭科天麻屬植物，是我國(guó)名貴中藥材，具有息風(fēng)、定驚，治眩暈眼黑、頭風(fēng)頭痛、肢體麻木、止痙等功效。近年來(lái)的臨床研究表明，天麻能改善AD患者的學(xué)習(xí)記憶功能，具有提高患者生活能力的作用[2]。小草壩天麻是云南省昭通市彝良縣小草壩鎮(zhèn)的特產(chǎn)，其品質(zhì)優(yōu)良，藥用價(jià)值高。且據(jù)分析檢測(cè)，彝良小草壩天麻的天麻素、無(wú)機(jī)元素和氨基酸含量明顯優(yōu)于省外主要產(chǎn)地的天麻[3]。據(jù)報(bào)道，東莨菪堿所致學(xué)習(xí)記憶障礙模型被認(rèn)為是AD藥物研究經(jīng)典的初篩模型[4]。為了探究小草壩天麻對(duì)AD的功效與作用，本文采用東莨菪堿建立小鼠記憶獲得障礙模型，通過(guò)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察天麻提取物對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響，并測(cè)定腦組織、海馬組織及皮層組織中的乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AchE)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)的含量，初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組實(shí)驗(yàn)采用SPF級(jí)ICR小鼠135只，♂，體質(zhì)量(22±2)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證編號(hào)：No.11400700227833)，隨機(jī)分為6組(每組15只)：空白組及模型組分別以超純水灌胃，每只0.2 mL；陽(yáng)性藥石杉?jí)A甲組以石杉?jí)A甲0.08 mg·kg-1·d-1灌胃；小草壩天麻水提物低、中、高劑量組分別以10、20、40 mg·kg-1·d-1灌胃，連續(xù)15 d進(jìn)行預(yù)防性給藥。后進(jìn)行為期4 d的水迷宮學(xué)習(xí)訓(xùn)練。學(xué)習(xí)結(jié)束后，正式進(jìn)行5 d水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)，1 d水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)。

1.2藥物與試劑小草壩天麻購(gòu)于云南省彝良縣，天麻水提物由北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所化學(xué)中心提供；東莨菪堿標(biāo)準(zhǔn)品(貨號(hào)：BWB50313)、石杉?jí)A甲中藥對(duì)照品(批號(hào)：07041114)，由北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院提供；考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒 (批號(hào):20170908)、AChE測(cè)試盒(批號(hào):20170825)、MDA測(cè)試盒(批號(hào)：20170919)、SOD測(cè)試盒(批號(hào)：20170922)，均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3儀器Morris水迷宮(直徑100 cm,水深50 cm,安全平臺(tái)直徑9 cm)及視頻分析系統(tǒng)，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所提供，型號(hào)DMS-2；離心機(jī)(深圳安科高技術(shù)股份有限公司); 酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek)；高通量組織研磨儀(北京鼎昊源科技有限公司)。

1.4方法

1.4.1水迷宮篩選 小鼠進(jìn)行水迷宮篩選前，先將小鼠放在平臺(tái)上20 s，讓其認(rèn)知平臺(tái)，然后將小鼠從平臺(tái)對(duì)角象限頭朝水迷宮內(nèi)壁放入水中，觀察其2 min內(nèi)能否找到平臺(tái)，能找到平臺(tái)的納入正式實(shí)驗(yàn)，不能找到平臺(tái)的小鼠人為將其引導(dǎo)上平臺(tái)停留20 s，10 min后進(jìn)行第2次篩選實(shí)驗(yàn)，能找到的納入正式實(shí)驗(yàn)，兩次都不能找到平臺(tái)的小鼠剔除出實(shí)驗(yàn)。

1.4.2水迷宮訓(xùn)練 將篩選合格的小鼠進(jìn)行4 d水迷宮訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)，訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)同篩選實(shí)驗(yàn)方法，如此連續(xù)訓(xùn)練10次，確保每只小鼠都能在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)找到平臺(tái)。訓(xùn)練期間按相應(yīng)劑量給藥。

1.4.3小鼠定位航行實(shí)驗(yàn) 水迷宮實(shí)驗(yàn)周期為6 d，定位航行實(shí)驗(yàn)周期為5 d，正常給藥后，在水迷宮實(shí)驗(yàn)小鼠入水前20 min，一次性腹腔注射東莨菪堿3 mg·kg-1，復(fù)制小鼠學(xué)習(xí)記憶獲得障礙模型，空白組小鼠注射相應(yīng)劑量無(wú)菌生理鹽水。自動(dòng)記錄小鼠第1次找到隱匿平臺(tái)時(shí)間(逃避潛伏期)等各項(xiàng)指標(biāo)。

1.4.4小鼠空間探索實(shí)驗(yàn) 空間探索實(shí)驗(yàn)周期為1 d，實(shí)驗(yàn)時(shí)不給藥，僅在小鼠入水前20 min進(jìn)行記憶障礙模型造模。移去平臺(tái)，自動(dòng)記錄第1次到達(dá)原平臺(tái)所在位置時(shí)間和跨越平臺(tái)次數(shù)，時(shí)間為120 s。水迷宮注意事項(xiàng)：平臺(tái)低于水面1 cm，水溫(25.0±1.0)℃，實(shí)驗(yàn)期間迷宮外參照物保持不變。

1.5小鼠組織制備及生化指標(biāo)測(cè)定

1.5.1腦組織勻漿的制備 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠處死，取出腦組織，分離每組小鼠大腦皮質(zhì)和海馬，置于離心管中，-80℃冷凍保存。制備勻漿時(shí)，取約100 mg組織，加入9倍量0.9%氯化鈉溶液，置EP管中，并放入鋼珠，于高通量組織研磨儀中充分研磨，制成10%腦組織勻漿，3 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液備用。

1.5.2腦組織蛋白含量測(cè)定 取10%腦組織勻漿液100 μL，按考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定測(cè)試盒說(shuō)明書操作步驟和計(jì)算公式，酶標(biāo)儀在 595 nm波長(zhǎng)處比色，測(cè)定海馬組織及皮層組織蛋白濃度，以此作為小鼠腦組織蛋白定量。

1.5.3腦組織AChE活力測(cè)定 取10%海馬及皮層組織勻漿液各40 μL，按AChE測(cè)試盒說(shuō)明書，酶標(biāo)儀在412 nm波長(zhǎng)處比色，測(cè)定海馬組織及皮層組織勻漿中 AChE活力。

1.5.4腦組織SOD活力測(cè)定 取10%海馬及皮層組織勻漿液各20 μL，按SOD測(cè)定試劑盒說(shuō)明書，酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處比色，測(cè)定海馬組織及皮層組織勻漿中SOD活力。

1.5.5腦組織MDA含量測(cè)定 取10%海馬及皮層組織勻漿液各20 μL，按MDA測(cè)試盒說(shuō)明書，酶標(biāo)儀在532 nm波長(zhǎng)處比色，測(cè)定海馬組織及皮層組織勻漿中MDA含量。

2 結(jié)果

2.1天麻對(duì)小鼠定位航行實(shí)驗(yàn)的影響Fig 1的定位航行實(shí)驗(yàn)路徑圖結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組小鼠尋找平臺(tái)所需的時(shí)間明顯增多，說(shuō)明記憶障礙模型造模成功。石杉?jí)A甲組和天麻組與模型組相比，尋找平臺(tái)所需時(shí)間明顯減少。

Fig 1 Comparison of path diagramsfor positioning navigation experiments

2.2天麻水提物對(duì)小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)的影響Fig 2的水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)路徑圖結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組小鼠在目標(biāo)象限占比沒(méi)有明顯趨勢(shì)；與模型組相比，石杉?jí)A甲組和天麻組在目標(biāo)象限時(shí)間占比明顯增多，小鼠更趨向于目標(biāo)象限。

Fig 2 Comparison of path diagramsfor positioning sailing experiment

空間探索實(shí)驗(yàn)潛伏期、小鼠在目標(biāo)象限時(shí)間及路程見(jiàn)Fig 3。結(jié)果顯示，對(duì)潛伏期而言，模型組小鼠潛伏期相比空白組更長(zhǎng)，即模型組第1次找到平臺(tái)花費(fèi)的時(shí)間要比空白組更多(P<0.05)；天麻組相比于模型組，其潛伏期短，其中高劑量組差異有顯著性(P<0.01)。對(duì)目標(biāo)象限時(shí)間而言，模型組小鼠在目標(biāo)象限所處的時(shí)間相比空白組更少(P<0.01)，石杉?jí)A甲組差異也有顯著性(P<0.01)；相比于模型組，天麻組在目標(biāo)象限所處時(shí)間更長(zhǎng)，中、高劑量組差異有顯著性(P<0.05)。同理，對(duì)目標(biāo)象限路程而言，模型組目標(biāo)象限路程相比于空白對(duì)照組更短(P<0.05)；相比模型組，石杉?jí)A甲組目標(biāo)象限路程明顯增加(P<0.05)，天麻組中劑量差異具有顯著性(P<0.05)。

2.3天麻水提物對(duì)小鼠AchE活性的影響海馬組織和皮層組織AchE活力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)Fig 4。海馬組織和皮層組織模型組的AchE活力相比于空白組均有明顯的升高(P<0.01)。海馬組織中，與模型組相比，小草壩天麻AchE活力明顯降低(P<0.05)；皮層組織中，與模型組相比，低劑量組AchE含量明顯降低(P<0.01)。

2.4天麻水提物對(duì)小鼠SOD含量的影響海馬組織和皮層組織SOD活力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)Tab 1。相比于對(duì)照組，皮層組織模型組的SOD活力明顯降低(P<0.05)；天麻給藥組SOD活力與模型組相比明顯升高(P<0.05，P<0.01)。海馬組織SOD活力組間差異無(wú)顯著性。

2.5天麻水提物對(duì)小鼠MDA含量的影響海馬組織和皮層組織MDA活力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)Tab 2。模型組海馬組織中MDA含量相比于對(duì)照組明顯升高；天麻給藥組海馬組織中MDA活力與模型組相比明顯降低(P<0.01)。皮層組織中MDA含量組間差異無(wú)顯著性。

Fig 3 Result of space exploration

3 討論

AD早期會(huì)出現(xiàn)輕度膽堿能功能障礙，膽堿能系統(tǒng)活性降低的程度也與認(rèn)知功能障礙的程度有關(guān)。因此，研究膽堿能系統(tǒng)對(duì)記憶的影響，以及利用現(xiàn)有的藥理學(xué)工具對(duì)繼發(fā)性功能障礙恢復(fù)也是至關(guān)重要的[5]。訓(xùn)練前，由東莨菪堿所致的膽堿能阻滯可以導(dǎo)致順行記憶障礙，學(xué)習(xí)記憶受損[6]。東莨菪堿誘導(dǎo)的記憶障礙可作為老年記憶障礙和AD記憶障礙的模型，是抗AD藥物實(shí)驗(yàn)研究中常用的造模藥物之一[7]。而天麻對(duì)于改善記憶、延緩衰老、增強(qiáng)免疫力等方面臨床應(yīng)用效果明顯[8]。通過(guò)研究東莨菪堿記憶障礙模型，評(píng)價(jià)彝良小草壩烏天麻對(duì)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶的影響，結(jié)果表明，小草壩烏天麻可明顯改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力；另外，還發(fā)現(xiàn)天麻的作用機(jī)制可能與抑制AchE活性有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與韓春妮等[2]通過(guò)采用Hestrin堿性羥胺比色法，根據(jù)組織濕重計(jì)算乙酰膽堿含量測(cè)定天麻提取物對(duì)記憶獲得障礙模型小鼠影響所得結(jié)果一致。

Fig 4 Result of AchE activity in hippocampal

Tab 1 Result of SOD activity inhippocampal and cortical

*P<0.05,**P<0.01vsmodel;#P<0.05vscontrol

Tab 2 Result of MDA levels in hippocampal

**P<0.01vsmodel;##P<0.01vscontrol

海馬是人類和其他哺乳動(dòng)物前腦膽堿能系統(tǒng)的重要區(qū)域，在空間導(dǎo)向和鞏固長(zhǎng)期記憶中起著重要作用[9]。而記憶的鞏固依賴于神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，其中，中樞膽堿能系統(tǒng)參與了主要的學(xué)習(xí)和記憶的過(guò)程。據(jù)報(bào)道，AD患者的一個(gè)重要特征表現(xiàn)是乙酰膽堿(Ach)含量降低，AChE活力升高[10]。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，天麻另外的作用機(jī)制有可能通過(guò)增強(qiáng)SOD活力及降低MDA含量實(shí)現(xiàn)。另外，相比明建等[11]的研究，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索了小草壩天麻水提物的作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)在考察Ach和MDA含量的同時(shí)，還考察了SOD含量，目的是確證小草壩天麻是否對(duì)抗氧化能力有一定的作用。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，小草壩天麻改善學(xué)習(xí)記憶能力可能與一定程度上增強(qiáng)小鼠的抗氧化能力有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)側(cè)重于評(píng)價(jià)彝良小草壩烏天麻的道地性，選用了道地藥材彝良小草壩烏天麻作為受試藥物來(lái)源。與劉智慧等[12]選用天麻素等單體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)相比，本實(shí)驗(yàn)使用了天麻水提物，著重凸顯天麻整體的作用與藥效。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小草壩天麻在改善小鼠學(xué)習(xí)記憶方面有較好的作用，這為提升彝良小草壩烏天麻的道地藥材價(jià)值提供了可靠的依據(jù)。

綜上所述，本研究比較了不同劑量的天麻水提物在東莨菪堿導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶障礙模型中的作用，并分析了其可能作用機(jī)制。另外，天麻的鎮(zhèn)靜、抗衰老等作用具體作用通路還未見(jiàn)報(bào)道，進(jìn)一步的研究還可從深入探討天麻對(duì)記憶障礙影響的機(jī)制入手，確證其信號(hào)通路。同時(shí)，也可考慮使用其他行為學(xué)方法來(lái)考察相關(guān)指標(biāo)，進(jìn)一步研究天麻的作用機(jī)制，為天麻的藥理藥效提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所藥理毒理中心實(shí)驗(yàn)室完成，感謝所有參與實(shí)驗(yàn)的老師及同學(xué)們！)