微流控技術中的微流體控制與應用

陳昱

高性能計算所，新加坡科技研究局，新加坡 138632

1 簡介

微流控是一種在微米尺度下對流體進行操控的科學技術，并且可以將生物、化學等多種實驗室功能微縮到一個很小的芯片上，因此微流控芯片也被稱為芯片實驗室（Lab-on-a-chip, LOC）。微流控最大的優(yōu)勢和特征就是眾多技術單元與流程可以通過微通道相連，在微小的平臺上靈活組合和大規(guī)模集成，能夠快速、自動、高通量、低成本地對生物、化學指標進行檢測，從而實現一個完整實驗室的復雜功能。由于尺寸微小，微流控芯片檢測僅需處理極微量的流體，可以極大地節(jié)省昂貴生化檢測試劑成本。

1.1 微流控技術的提出和發(fā)展簡史

20世紀60年代，微電子行業(yè)廣泛使用的光刻技術逐漸發(fā)展，被用于在硅片上創(chuàng)建各種微米或亞微米尺寸的機械結構，并最早應用于壓力傳感器的制造（1966年）。隨后這套技術繼續(xù)發(fā)展成為微機電系統(tǒng)（MEMS）技術，廣泛用于開發(fā)各種流體處理設備，如通道、混合器、閥門、泵等，這才使得在微尺度上對氣、液體樣本的操控和檢測成為可能。

一般認為，第一個芯片實驗室（LOC）系統(tǒng)是由斯坦福大學的Terry[2]于1979年開發(fā)的氣相色譜儀[3,4]。然而，直到20世紀80年代末至20世紀90年代初，微泵及流量傳感器才被陸續(xù)開發(fā)出來。與此同時，基于將完整的實驗室分析系統(tǒng)集成到芯片上的流體處理概念的出現，才使得LOC研究得以顯著增長[3]，見圖1。

20世紀90年代中期，電泳分離連同隨后的DNA微陣列等基因組學應用在微流控芯片上的實現，使得同時對大量樣本進行快速分析成為可能，展示了微流控芯片作為一種分析化學工具的強大潛力，大幅提升了科研人員對其在研究和商業(yè)領域的興趣。美國軍方特別是美國國防部高級研究計劃局（DARPA）對便攜式生化檢測系統(tǒng)研究的大力支持，引燃了世界范圍內對微流體芯片研究的熱情。

1.2 微流控技術的重要意義和廣闊應用前景

圖1 微流控芯片示意圖

微流控芯片技術的出現與發(fā)展有著深刻的內在必然性。首先，各種設備的微型化是近一個世紀以來的大趨勢，既跟人類認知能力深入有關，也是日趨緊張的能源資源的自然要求。其次，很多設備與技術的發(fā)展應用和流體的控制緊密相關，而微納尺度下流動的特征是一個全新的領域，很多方面至今尚未被人們徹底認識，急需更多的投入和研究。第三，微流控芯片技術與信息學緊密相關，特別隨著人類基因組計劃的開展以及基因療法、個性化醫(yī)療的日益發(fā)展，人們對自身和整個世界所包含的信息的理解越來越深入，自然對分析和調控工具提出了更高的要求。第四，微流控芯片與系統(tǒng)化、集成化、模塊化的發(fā)展理念不謀而合，符合大的時代發(fā)展趨勢，為人類提供了既能夠操控微小物體，同時又能把握全局和系統(tǒng)的強大工具。

如此強大、新穎的微流控系統(tǒng)，仍然處于飛速的發(fā)展之中，并正被應用于越來越廣闊的領域。首先，從原則上講，幾乎任何分析化學的檢測都能通過微流控芯片完成。其次，更重要的是，隨著技術的發(fā)展和需求的增長，微流控芯片近幾年的發(fā)展方向逐漸轉變?yōu)闃嫿ú煌愋偷男酒瑢嶒炇遥热缗c化學合成、生物、材料、光學、信息、能源等相結合，從而應用在不同的領域，如環(huán)境監(jiān)測、醫(yī)學診斷、細胞組學，以及快速藥物合成與篩選器等。

2 微流體控制技術

微流控芯片由微通道網絡將不同功能的模塊相互連接而成，樣品在空間上依次經過不同模塊，從而實現時間上依次進行不同操作的目的。如此各模塊之間樣品的輸運依賴于流體的流動，這使得微流體力學成為微流控芯片技術的基礎。起初研究者認為在連續(xù)性方程框架下微流動和宏觀尺度流動很類似，但隨著研究不斷深入，微尺度下流動的特殊性也逐漸顯露出來。由于被廣泛應用于多種生物樣品的檢測，微流控芯片中包含很多諸如非牛頓流體流動，粒子、細胞、液滴、氣泡的運動等的特殊流動。另外，由于微流控芯片的高度集成性，微尺寸流動經常受多物理場——電場、磁場、聲、光、熱等作用的影響。故而微尺度下流體運動的規(guī)律和特征問題吸引了眾多不同領域的研究者的興趣和目光。接下來主要介紹微流控芯片中流體流動問題的分類和特征，同時簡單引入流動驅動及控制等具體技術。

2.1 微納流體的特點

首先考慮一個最基本的問題，當流動尺寸縮小到微米量級時，流體力學的基本假設（連續(xù)性假設和無滑移邊界條件等）是否還成立。20世紀90年代初，Pfahler[5]進行管道中壓力流動實驗時，發(fā)現流動阻力系數與理論預測值不吻合，引起了人們對微尺度下連續(xù)性假設與方程適用性的懷疑與關注。直到2000年以后，根據大量實驗結果的分析，學術界基本認同在微米尺度下連續(xù)性假設仍然成立，然其在納米尺度下的適用性仍然存疑。同時，在宏觀尺度下被廣泛認可的邊界無滑移假設在微尺度下也受到了挑戰(zhàn)。這是由于此時流動特征尺度縮小到與分子滑移長度相當的程度，流體在固體表面的滑移不再可以忽略。而隨著界面流動研究的逐漸深入，上述的邊界滑移問題已得到了較好的理解和解決。另一方面，由于尺寸縮小，表面張力等面積力對微流體的作用比體積力（重力、浮力等）大得多，會逐漸顯示出其主導作用。

樣品在微流控芯片內不同功能的模塊間輸運依賴流體的流動，因此，如何實現微尺度下流動驅動、控制成為芯片設計的關鍵。這涉及流體的驅動、通斷、樣品混合、粒子捕捉、細胞聚焦、分離等等。一般地，控制微流控芯片內樣品輸運的流動可以大致分為兩大類：連續(xù)簡單介質流動、液滴生成與運動。接下來分別介紹他們的控制方法。

2.2 連續(xù)相流體控制

簡單介質流動一般指連續(xù)、均質的液相流動，流體力學上可以作為單相流處理，如緩沖液、稀相蛋白分子流等，是微流控芯片中處理的最常見的樣品形式，如何在微流控芯片中驅動、控制、混合、分離、檢測這種狀態(tài)的樣品顯得尤為重要。

2.2.1 流動的驅動

連續(xù)相介質一般可以通過微泵產生壓差驅動、電滲流形式驅動等。

壓差驅動是指利用壓力抵抗流體在微通道內流動產生的粘性阻力從而驅動流體流動，可以通過注射泵、蠕動泵等產生所需的壓力，另外也可以在微流體芯片上集成壓差氣動微泵。壓差氣動微泵室由多個啟動微閥組成，PDMS薄膜在氣壓作用下產生形變，閥閉合，堵塞流體通道；相反氣壓撤去時，PDMS薄膜在彈性作用下恢復原狀，閥門開啟，流體流動通暢。順序操控多個閥門的開啟、閉合，就可以實現對微通道內流體的驅動。這一過程與宏觀尺度下的蠕動泵類似，見圖2。

圖2 注射泵、蠕動泵、基于PDMS的氣膜泵[6]

除了壓差驅動，微流控芯片中還常常會使用電滲流來驅動流體。制備微流體芯片常用的硅、玻璃和高分子聚合物（PMMA，PDMS）等材料表面常常發(fā)生水解并極化，形成硅烷醇表面基團并選擇性地吸附某種離子而帶電，相應地表面附近的液體中形成反離子，構成帶電表面和液體雙電層。當電場施加在流體上時，帶點流體被庫侖力驅動而移動，這種流動即電滲流。除了驅動樣品流動，電滲流是化學分離的重要技術，也是電泳分析的基礎。

由于流體黏性的作用，壓差驅動的微通道流動一般通道中心速度較高，靠近壁面速度較低，因此而出現的彌散現象（見圖3）對于一致性要求很高的檢測而言并不合適；另外，當微通道尺寸縮小，在同樣驅動壓力下流速會急劇降低。而如果利用電滲流，管道內速度分布均勻沒有彌散，并且管道尺寸縮小流速不降低，因為其只與電壓有關。所以，對于尺寸大的管道，使用壓差驅動流體比較有優(yōu)勢，相反電滲流對小尺寸流動意義更為重大。

2.2.2 流動的控制

對于一般微通道而言，閥門是流體控制的核心部件。由于其重要性，微型閥的研制早在微流控芯片誕生以前就引起了人們的廣泛關注。

圖3 壓差驅動的微通道流動彌散現象

對于電滲驅動的毛細管電泳等應用場景，在進樣通道施加不同的電壓，可控制樣品的進樣體積，當形成穩(wěn)定的進樣區(qū)帶后，切換電滲電壓，即可停止進樣過程。隨后在分離通道施加電壓，樣品便進入分離通道進行電泳分離。整個過程無須閥門的幫助，只需要通過電路切換控制電壓，流動控制和切換非常簡單。

然而對于壓力驅動的微流芯片需要使用實體閥門，其結構較為復雜，需控制通道的開合，并要求泄露低、功耗小、響應快、線性強。如雙晶片單向閥（圖4）由兩個晶片相接而成，在入口處有一彈性懸臂梁，當流體正向流動時，頂開懸臂梁，正常流動；當流體反向流動時，懸臂梁受反向壓力與晶片閉合，使通道閉合。另外，丙烯酰胺聚合體在高低電壓下具有不同性質，可以用來實現閥門開合的切換，低電壓下，空穴密集，閥門關閉；高電壓下，空穴張開，閥門打開。另外還可通過空氣壓力控制軟性PDMS薄膜來控制通道的開合，實現閥門的功能（圖5）。

圖4 單向閥門[7]

圖5 氣動閥門[8]

2.2.3 樣品介質的混合

有一些需要快速發(fā)生的反應，要求快速混合不同樣品，使得反應的不同組分充分接觸。混合有兩個機制：①溶度梯度驅動的擴散，②組分團隨流動產生的對流。然而微流體芯片尺度小雷諾數小，呈層流狀態(tài)，對流強度小，混合主要依靠擴撒。所以要增強混合，需要增加溶質之間的接觸面積，可以通過拉伸流體或剪切；和利用管路幾何交叉設計，將不同樣品分裂成許多微團再組合。

混合器按照是否需要外力一般分為兩種，被動式與主動式。被動式混合器通過在微通道加入擾流器，從而在流動中引入波動，與主流垂直的二次流，可以將樣品切割成更小的單元從而增強混合。與被動式不同，主動式混合器利用磁力、聲場力、電場力等外力來增強混合。如使用外部旋轉驅動微攪拌棒進行液體混合；通過在溶液中引入氣泡，聲場誘導停留在固體表面的氣泡產生震動，從而形成球形對流，加速混合；還可利用可變直流電場，產生變化電滲流混合樣品（圖6）。

圖6 各種不同增強混合技術

圖7 基于不同技術的檢測方法

2.2.4 分離、分析、檢測

經過進樣、反應等過程，最終樣品需要經過分離、分析與檢測，得到人們能夠理解的結果，提供有效地診斷依據（圖7）。

在微流芯片發(fā)展早期，電泳分離技術發(fā)展最快、成熟度最高，占有特殊的地位。介質中帶電粒子在電場作用下會形成定向遷移和泳動，被稱為電泳。由于各種物質分子的電荷數量與質量不同，導致其遷移速度不同，最終形成不同的譜帶，達到分離與甄別樣品的目的。

近年來，一些新的技術被應用于微流控芯片的檢測領域，如光學檢測、電化學檢測、質譜檢測等。激光誘導熒光時使用最廣泛的光學檢測方法，對具有熒光官能團或者可以衍生產生熒光的核酸、蛋白質、氨基酸等生化樣品進行檢測、分析，其檢測極限可以達到10-13-10-9mol/L。另外，利用光子技術、雙光子激發(fā)等技術甚至可以達到單分子檢測精度。電化學方法利用待檢測物質導通電流、電導率、阻抗譜以及半透膜兩端的電位差來進行檢測。質譜檢測是使樣品中各組分在離子源中發(fā)生電力，生成不同荷質比的帶正電荷粒子，經加速電場作用，形成粒子束，進入質量分析器，利用電場和磁場使得離子發(fā)生相反的色散，從而將他們鑒別出來的方法。另外，利用聲表面波（SAW）、薄膜體聲波（FBAR）、紅外線（IR）等傳感器對其表面附著物變化的敏感性，可以探測樣品與傳感器表面抗體探針的特異性反應。另外，超材料和聲表面波等技術可以直接對樣品的一些物理性質（如黏性、介電常數等）進行測量，從而判斷出樣品的變化。

2.3 液滴控制

為了更精確地控制樣品體積與數量，進一步降低能耗，提高自動化程度與通量，近來，微流控領域發(fā)展了將液體分割成液滴進行更小體積操控的技術。與連續(xù)相不同，為了得到離散相的液滴，通常會使用不同性質兩種液體相互隔絕，一種作為連續(xù)相，一種作為分散相，分散相以微小體積單元形式分布在連續(xù)相中，形成液滴在芯片中運動。

與連續(xù)相戒指類似，基于液滴的微流控芯片技術，核心在于液滴的生成、樣品的加入與混合以及檢測。

2.3.1 液滴生成

“T”形結構通道和“流動聚焦”被廣泛用來在微流控芯片中生成液滴。在“T”形結構通道中，油相和水溶液分別從水平和數值通道中流出，由于兩者不相容，在交叉處相遇后形成水/油界面，水溶液在推動力的擠壓和油相的剪切作用下，被拉伸最后表面張力不足以抵抗剪切力，斷裂成為液滴。另外還可利用油相從水溶液兩側的通道流出，對水溶液產生夾流“聚焦”作用，水溶液受到來自兩側堆成剪切力，液滴形成過程比“T”形結構更穩(wěn)定，大小可控范圍更廣。一般可以通過調節(jié)水相、油相的流速來調整液滴的大小，還可以用多種組分溶液形成一個液滴，甚至可以液滴生成結構嵌套成多核或者多層液滴，見圖8。

圖8 液滴生成的不同方法

2.3.2 混合、操控

使用液滴作為微反應器，可以直接將樣品和試劑包入液滴，以液滴生成時的狀態(tài)作為反應的初始條件；如果反應復雜，可以在液滴生成單元的下游增加側向通道，當液滴經過時，將溶液注入液滴，并開始下一步反應。再經過微通道時，由于通道內壁的摩擦作用，液滴內部會產生兩個堆成的漩渦流，一定程度上加速內部溶液的混合。還可以將直通道改成“S”形，液滴內部的一對漩渦會變?yōu)榇笮〔灰?，并別經過“S”形彎折時，兩個漩渦會交換大小，大大增強對流速度，加快混合，見圖9。

有時對于復雜的多步反應，需要對液滴進行可控融合，首先在芯片不同位置生成飽含不容溶液的液滴，并調整速度使其一致，并通過微通道尺寸、結構等控制它們在特定位置相遇。有時，可以通過它們表面張力自動融合，還有可能需要電和光熱來促進融合的過程。

除了在通道中運動，液滴還可以受控在平面上運動，進行反應和檢測。通過液滴表面的電浸潤現象，通過向電極施加電壓改變節(jié)點之層的固液表面張力，實現液滴的產生，并控制離散（單個）液滴輸運和分裂，被稱為數字液滴（digital droplet,dd）微流控芯片技術。

3 應用舉例

3.1 聚合酶鏈反應（PCR）

聚合酶鏈反應（PCR）是在體外模擬自然DNA復制過程的核酸擴增技術，經典PCR循環(huán)由Mullins發(fā)明。利用引物延伸核酸的某個區(qū)域而實現重復雙向DNA合成，其靈敏度和特異性都很高，而且操作簡便、快捷，系統(tǒng)簡單。后來又有開發(fā)環(huán)介導的等溫PCR技術（LAMP）和通過高溫變性、低溫退火、酶催化三步的循環(huán)PCR擴增。相比于常規(guī)宏觀尺度PCR，在微流控芯片上實現PCR有如下幾個優(yōu)勢：①有效減少熱循環(huán)系統(tǒng)體積，熱容低，升/降溫速度提高，反應時間縮短；②反應體系體積減小，溫度均勻性提高；③樣品變少，試劑消耗降低；④各模塊變小，有利于集成化。

循環(huán)PCR擴增的成功關鍵在于快速而準確地控制循環(huán)溫度，利用微流控芯片集成度高的優(yōu)勢，可以將PCR反應器、微加熱器、溫度傳感器、電泳微通道、激光熒光誘導檢測全部集成到微小的芯片上。除了前述方法在儲液池直接反復加熱/冷卻反應液，另外還可以在芯片上構建具有穩(wěn)定的PCR溫度不同區(qū)域，讓反應液通過蛇形迂回的微通道，讓其依次經歷高溫變形、低溫退火、酶催化三步，省去復雜的控制程序和煩瑣的微傳感器加工步驟。除了傳統(tǒng)的基于連續(xù)介質的PCR擴增，還有將樣品分散成液滴，把每個液滴作為獨立的微反應器的液滴數字PCR。首先將微量樣品大倍數稀釋，再將其依次送入液滴，使得每個液滴中的待測DNA不超過1個，再將所有液滴置于相同條件下進行PCR擴增，之后利用如激光熒光反應等發(fā)發(fā)進行檢測。根據泊松分布原理和檢測出的陽性反應液滴數目，可以推算出原始樣品中特定DNA片段的濃度，實現絕對定量甚至單分子檢測的目標。

3.2 細胞仿生實驗室

微流控芯片仿生實驗以細胞實驗為基礎，通過微流芯片中三維細胞培養(yǎng)和共培養(yǎng)來模擬生物體內體系的環(huán)境，從而更真實反應和研究活體內復雜的生化反應。目前微流控芯片的潛力在細胞研究中已得到充分的發(fā)揮，微米量級且相對封閉的細胞培養(yǎng)、分選、裂解等微流控芯片細胞實驗室操作單元均已構建。在微流控芯片內合成仿生材料上培養(yǎng)細胞，再通過不同尺寸和形狀的管道網格將不同細胞團連接形成組織、器官，可以觀察體液在細胞、組織以致氣管內或者它們之間流動，這種器官芯片系統(tǒng)包含細胞、組織、血液、埋管、組織、組織界面等器官內微環(huán)境的全部要素，更接近真實的生物體系。生物系統(tǒng)是一個整體，包含很多局部，局部之間通過很多生物化學網格相互影響并對環(huán)境做出響應，在微流控空芯片上構建器官模擬一個活體的行為，可以更方便、準確、可控地從系統(tǒng)生物學角度研究活體中整體和局部的種種關系。從本質上講，微流控芯片仿生實驗室提供了一種在相對簡單的生物體外對極其復雜的生物內體系開展模擬研究的途徑。雖然芯片仿生實驗室可能并不能完全反映真實情況，但是在人體研究遇到困難，動物研究又與人體差異過大的難以接受的情況下，例如藥物毒性這樣的復雜問題，或許可以從人體器官系統(tǒng)角度提供更深入的探討和理解，見圖10。

4 結語

幾年來，隨著微流控芯片這一科技領域的一系列重大突破，以及人們對其認識的不斷深入，其在特殊應用場景的特性逐漸脫穎而出，吸引了疾病診斷、藥物篩選、材料合成、環(huán)境檢測、食品安全等方向的廣泛關注，并且在不斷進行產業(yè)化轉型?？傮w而言，微流控芯片技術應用廣泛，在提供快速、低廉、便攜的解決方案方面有很大潛力，對人類未來的生活方式和生存質量產生深遠影響，在未來20年內將引起廣泛和激烈的產業(yè)化、商業(yè)化競爭。

但同時，微流控芯片技術仍然面臨許多挑戰(zhàn)。首先是市場的接受度還處于起步階段，起步較早的芯片診斷技術，現在仍處于與現有成熟技術的競爭階段，而液滴技術、哺乳動物細胞和仿生技術，正在被人們逐漸接受。同時，盡管微流控芯片具有多單元在微小平臺靈活組合與集成的優(yōu)勢，但如何在確保穩(wěn)定、可靠結果的前提盡量控制制造成本，對實際產業(yè)化道路提出很高的要求。另外，雖然微尺度下的流動特征已經被人們研究了較長時間，很多問題也得到了解決，但仍然存在許多未解決的問題，例如氣液界面運動、氣相溶解與滲透；另外隨著生化檢測要求的提高，微流控芯片尺寸越來越小（納米尺度），而在如此小的尺度的管道內，溶液與樣品溶質分子以數十數百的量級通過各種單元模塊，經典流體力學中的連續(xù)性假設不再適用，預測流體在納米尺度下的運動成為重點研究目標。