荔波唇柱苣苔種子誘導(dǎo)組織培養(yǎng)和快速繁殖

玉屏 王萬(wàn)海 熊志斌 王蓮輝

(1.貴州茂蘭國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局，貴州荔波558400；2.貴州省林業(yè)科學(xué)研究院，貴州貴陽(yáng)550005)

引言

荔波唇柱苣苔 (Chirita liboensis)為苦苣苔科(Gesneriaceae)唇柱苣苔屬 (Chirita)多年生草本植物，僅產(chǎn)于貴州荔波，為荔波特有種。荔波唇柱苣苔生于石灰?guī)r地區(qū)低山林下陰濕處石上，是適應(yīng)于石灰?guī)r堿性生長(zhǎng)環(huán)境的喜鈣植物，具有明顯的石生性和喜鈣性，對(duì)生長(zhǎng)有較為嚴(yán)格的專一性，且種群植株數(shù)量一般較少。荔波唇柱苣苔還具有較好的觀賞性，其花色藍(lán)中帶紫，紫中有藍(lán)，花朵較多，葉片大，葉脈銀色，適宜于室內(nèi)盆栽觀賞。

該物種因長(zhǎng)在深山無(wú)人識(shí)，未能得到較好的開發(fā)利用，為達(dá)到商品化生產(chǎn)和保護(hù)野生資源的作用，本文以荔波唇柱苣苔的果實(shí)為外植體，進(jìn)行無(wú)菌播種開展組培試驗(yàn)，篩選最適合播種誘導(dǎo)、增殖分化、生根培養(yǎng)基，研究荔波唇柱苣苔快速繁殖技術(shù)，為荔波唇柱苣苔規(guī)?；嘤_發(fā)利用提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

選用茂蘭喀斯特地區(qū)生長(zhǎng)的野生荔波唇柱苣苔果實(shí)作為組培外植體，所選的果實(shí)長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)良，無(wú)病蟲害。種子采摘后立即帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行組織培養(yǎng)等研究。

1.2 試驗(yàn)方法

將采集的荔波唇柱苣苔果實(shí)，用洗衣粉溶液洗去外表污染物，然后用流動(dòng)自來(lái)水反復(fù)沖洗干凈備用。在超凈工作臺(tái)上將洗凈的果莢用75%酒精溶液滅菌30S后用無(wú)菌水沖洗3次，然后用0.1%HgCl2溶液振蕩5min，最后用無(wú)菌水反復(fù)沖洗5～6次，放在無(wú)菌紙上吸干果實(shí)表面水分。將消毒好的荔波唇柱苣苔果實(shí)用消毒剪刀將一端剪開一小口，輕輕抖動(dòng)果實(shí)把里面的種子均勻播散在培養(yǎng)基上。

所有培養(yǎng)基均添加4g/L瓊脂和20g/L蔗糖，pH值調(diào)節(jié)為5.4～5.8。接種后培養(yǎng)條件為：溫度 (25±3)℃， 光照強(qiáng)度 30～40μmol·m-2·s-1， 光照時(shí)間12h/d。

1.3 誘導(dǎo)種子萌發(fā)

將消毒好的種子均勻播種于MS基本培養(yǎng)基上，進(jìn)行無(wú)激素添加培養(yǎng)與附加不同激素濃度配比的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)種子萌發(fā)對(duì)比試驗(yàn)。設(shè)計(jì)NAA濃度為0.1mg/L， 6-BA 濃 度 為 0.1、 0.5、 1.0、 1.5、2.0mg/L5個(gè)濃度梯度。每個(gè)處理10瓶，每瓶播種3團(tuán)，每個(gè)處理重復(fù)3次。45d后，觀察種子萌發(fā)的情況，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。萌發(fā)率＝萌發(fā)團(tuán)數(shù)/接種團(tuán)數(shù)×100%

1.4 原球莖增殖分化的培養(yǎng)

將萌發(fā)出的原球莖和小芽接種于添加不同濃度6-BA的MS基本培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。設(shè)計(jì)NAA濃度為0.1mg/L， 6-BA 濃度為 0.1、 0.3、 0.5、 0.8、 1.0、1.2、1.3、1.5mg/L8個(gè)濃度梯度。每個(gè)處理10瓶，每瓶接種3團(tuán)原球莖和小芽，每個(gè)處理重復(fù)3次。30d后觀察增殖情況，統(tǒng)計(jì)增殖倍數(shù)。

1.5 壯苗生根的培養(yǎng)

等分化出的植株生長(zhǎng)出3～5片葉的時(shí)候，將單株小苗接種到 NAA濃度為 0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L5個(gè)濃度梯度的MS培養(yǎng)基上。每個(gè)處理接種10瓶，每瓶接種1株小苗，每個(gè)處理重復(fù)3次。觀察小苗生根情況并計(jì)算生根率。生根率＝生根瓶數(shù)/接種瓶數(shù)×100%。

1.6 數(shù)據(jù)處理方法

用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，用SPSS18.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著的采用多重比較。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 激素的添加對(duì)種子萌發(fā)的影響

荔波唇柱苣苔接種于表1所示的培養(yǎng)基上，45d后6個(gè)處理均有種子萌動(dòng)形成原球莖。

根據(jù)方差分析及對(duì)不同試驗(yàn)處理進(jìn)行多重比較后，結(jié)果表明 (表1)不同濃度激素處理對(duì)荔波唇柱苣苔種子萌發(fā)的影響表現(xiàn)差異顯著。當(dāng)6-BA濃度低于0.1mg/L時(shí)種子萌發(fā)率開始降低，以不添加激素萌發(fā)率為最少。當(dāng)6-BA濃度大于1.0mg/L時(shí)種子萌發(fā)出現(xiàn)膨大，隨著激素濃度增高，膨大現(xiàn)象越嚴(yán)重。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)，其中以處理3為最佳，萌發(fā)率達(dá)98%，萌發(fā)原球莖疏松呈綠色。15d后，新芽數(shù)量逐漸增多，出現(xiàn)少量小芽展出2片真葉的幼芽。

2.2 不同激素濃度組合對(duì)原球莖和小芽增殖分化的影響

將初代培養(yǎng)形成的原球莖和小芽分別轉(zhuǎn)接到MS為基本培養(yǎng)基的增殖培養(yǎng)基上，研究不同激素配比對(duì)原球莖和小芽增殖的影響。

根據(jù)方差分析及對(duì)不同濃度激素處理進(jìn)行多重比較分析，結(jié)果顯示 (表2)不同濃度激素處理對(duì)荔波唇柱苣苔增殖分化的影響表現(xiàn)差異不顯著。不同濃度值激素對(duì)原球莖和小芽均有增殖，增殖的數(shù)量雖然無(wú)明顯差異，但隨著6-BA濃度的升高分化出的小苗逐漸出現(xiàn)葉片卷曲，苗叢密集，過(guò)度微型化等現(xiàn)象，有部分葉片出現(xiàn)白化透明狀態(tài)。經(jīng)過(guò)對(duì)比，當(dāng)6-BA濃度為0.1mg/L時(shí)為最佳，增殖倍數(shù)高，形成植株形態(tài)快，且數(shù)量多。30d后，分化的原球莖和小芽形成植株形態(tài)，具有3～5片葉，葉片呈現(xiàn)綠色葉面上被白色絨毛，有少量白色須根出現(xiàn)。

表1 不同濃度激素處理對(duì)種子萌發(fā)率的影響

表2 不同濃度激素配比對(duì)增殖分化的影響

2.3 不同濃度NAA對(duì)荔波唇柱苣苔生根的影響

將分化生長(zhǎng)出4～5片葉以上的植株接種于MS基本培養(yǎng)基上，添加不同濃度的NAA(見表3)作為生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)無(wú)菌苗生根。從表3可知，荔波唇柱苣苔生根較容易，不同濃度的激素下均能生長(zhǎng)出根。但隨著NAA濃度升高，植株莖干生長(zhǎng)較快，約能長(zhǎng)出3個(gè)節(jié)間莖段但較脆弱，不利于出瓶栽培。經(jīng)觀察，當(dāng)NAA濃度為0.5mg/L時(shí)生根狀況和植株?duì)顩r為最佳，在小苗底部四周逐漸長(zhǎng)出數(shù)條白色的細(xì)根長(zhǎng)約0.5～1.5cm，45d后白色細(xì)根顏色逐漸變深變長(zhǎng)約3～5cm左右，葉片變大變寬，長(zhǎng)約3cm以上，寬約2～3cm，顏色呈深綠色，葉片被白色絨毛，生長(zhǎng)健壯。

表3 不同濃度NAA對(duì)生根的影響

2.4 荔波唇柱苣苔的煉苗與移栽

組培瓶苗的健壯度與移栽后的管理對(duì)苗的成活具有很大的影響。選擇生長(zhǎng)健壯的荔波唇柱苣苔植株開口煉苗后，將其栽培于消毒發(fā)酵好的鋸木面中，溫室內(nèi)培養(yǎng)30d后將小苗移到室外，放置在散射光照條件下培養(yǎng)，每天進(jìn)行噴霧保濕。荔波唇柱苣苔組培苗經(jīng)煉苗后，室外移栽成活率達(dá)85%以上。

3 結(jié)果與討論

本文以通過(guò)對(duì)荔波唇柱苣苔種子進(jìn)行無(wú)菌萌發(fā)誘導(dǎo)、增殖分化和生根培養(yǎng)的方式進(jìn)行研究，建立了荔波唇柱苣苔組織培養(yǎng)快速繁殖體系。

結(jié)果表明：在設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基中，種子萌發(fā)培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA；繼代增殖分化培養(yǎng)基為MS+0.1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA；生根壯苗培養(yǎng)基為：MS+0.5mg/LNAA。以上培養(yǎng)基均添加4g/L瓊脂和20g/L蔗糖，pH值調(diào)節(jié)為5.4～5.8。

4 意義與進(jìn)展

荔波唇柱苣苔是荔波特有種，屬于狹域性分布的類群，稀有性明顯，無(wú)論在科學(xué)研究上還是在物種保存上都有重要意義。荔波唇柱苣苔利用種子開展的組培培養(yǎng)和快速繁殖尚未見報(bào)道。