切取活檢對(duì)兔VX 2舌癌移植瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的影響及其機(jī)制研究

葉麗君，周新春，殷小佳，尚裕，魏巍，趙青

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院1腫瘤科，2病理科，3口腔科，湖北 襄陽(yáng)441000

舌癌（carcinoma of tongue）是臨床中常見(jiàn)的口腔惡性腫瘤，具有惡性程度高、早期頸部轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)。現(xiàn)階段舌癌的發(fā)病率逐年升高，而病理診斷是確診該病的金標(biāo)準(zhǔn)[1]。臨床工作中，對(duì)于疑似病例往往先進(jìn)行切取活檢，確診后再行擇期手術(shù)。但有研究指出，切取活檢會(huì)促進(jìn)多種鱗癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，但具體機(jī)制仍不清楚[2]。本研究通過(guò)構(gòu)建大白兔VX2舌癌移植瘤模型，觀(guān)察切取活檢對(duì)腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的影響，并初步探討其機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

VX2鱗狀細(xì)胞癌瘤株由北京協(xié)和醫(yī)院病理科獲得，新西蘭大白兔購(gòu)自武漢大學(xué)生命科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，戊巴比妥鈉（粉劑）購(gòu)自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司，抗核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗體均購(gòu)自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，SP免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 制作荷瘤兔

取生長(zhǎng)良好的腫瘤細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)至1×108/ml活細(xì)胞密度；兔術(shù)前禁食12 h，采用3%戊巴比妥耳緣靜脈注射進(jìn)行全麻，仰臥位固定于兔臺(tái)，取兔后腿內(nèi)側(cè)部位脫毛后注入1 ml腫瘤細(xì)胞懸液，4周左右在接種部位能觸及直徑3～4 cm的實(shí)性包塊，即為荷瘤兔。

1.3 兔VX 2移植瘤模型的構(gòu)建及切取活檢處理

切取荷瘤兔的腫瘤組織，去除肌肉組織及中心處的壞死組織，使用含雙抗的Hank’s液沖洗2遍后使用鋒利的眼科剪剪碎，使用0.25%胰酶消化液制備腫瘤細(xì)胞懸液，200目細(xì)胞篩過(guò)濾，制備細(xì)胞密度為5×108/ml的腫瘤細(xì)胞懸液。取48只雄性新西蘭大白兔，體重2.7～3.3 kg，全麻后固定于兔臺(tái)，使用5號(hào)皮試細(xì)針頭在舌側(cè)緣中1/3處舌黏膜下注入0.1 ml腫瘤細(xì)胞懸液，3周后將舌部成瘤兔（共45只）按體重由小到大進(jìn)行編號(hào)（1～45），采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為實(shí)驗(yàn)組23只及對(duì)照組22只。實(shí)驗(yàn)組全麻后切取腫瘤組織4 mm×4 mm×4 mm，4%多聚甲醛保存，對(duì)照組只進(jìn)行全麻處理。

1.4 取材及病理學(xué)觀(guān)察

術(shù)后第1、3、7、14、21天無(wú)痛處死兔子（前4次各組均取4只，最后1次全部處死），記錄每只兔子體重，切取完整舌部腫瘤及雙側(cè)頜下淋巴結(jié)，測(cè)量大小后將組織置于10%多聚甲醛中固定。將淋巴結(jié)標(biāo)本切片于蘇木素-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色后觀(guān)察是否有轉(zhuǎn)移。

1.5 原發(fā)灶生長(zhǎng)情況大體觀(guān)察

在第1、3、7、14、21天觀(guān)察并記錄兔子舌部腫瘤的大小。將兔子舌體牽出，游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)、寬、高，并計(jì)算腫瘤體積[3]。設(shè)定活檢前腫瘤體積（V1）、活檢取下腫瘤的體積（V2）、處死后取下腫瘤的體積（V3）。實(shí)驗(yàn)組的腫瘤體積變化：V實(shí)驗(yàn)=V3+V2-V1，對(duì)照組的腫瘤體積變化：V對(duì)照=V3-V1。

1.6 免疫組化染色檢測(cè)蛋白表達(dá)情況

采用免疫組化（SP）法檢測(cè)舌部腫瘤NF-κB、MMP-9、VEGF蛋白的表達(dá)情況。NF-κB、MMP-9、VEGF的抗體濃度均為1∶150，二氨基聯(lián)苯胺（3，3N-diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素復(fù)染后封片觀(guān)察，行半定量分析。細(xì)胞質(zhì)著色細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，按著色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)價(jià)表達(dá)情況。①按著色強(qiáng)度：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，褐色為3分。②按陽(yáng)性細(xì)胞所占比例：每個(gè)標(biāo)本選6個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野下的細(xì)胞數(shù)及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占比例，＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分。將兩項(xiàng)結(jié)果相加，≥1分為陽(yáng)性表達(dá)，≥4分為高表達(dá)，＞5分為過(guò)表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)-軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)表示，組間比較采用Fisher確切概率法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兔VX 2舌癌移植瘤切取活檢動(dòng)物模型的建立

經(jīng)舌部注射腫瘤細(xì)胞3周后，48只新西蘭大白兔有45只（93.75%）舌部成瘤。實(shí)驗(yàn)組于術(shù)后第15、20天各死亡1只，對(duì)照組于術(shù)后第19天死亡1只，死亡動(dòng)物取材，并計(jì)入臨近時(shí)間點(diǎn)。

2.2 術(shù)后原發(fā)灶生長(zhǎng)情況的比較

兔子注射腫瘤細(xì)胞后第1周未能觀(guān)察到明顯變化，第2周能看到舌部有小包塊形成，質(zhì)韌，第3周瘤體迅速增長(zhǎng)，體積明顯變大。實(shí)驗(yàn)組行切取活檢術(shù)，術(shù)后第1周腫瘤原發(fā)灶與對(duì)照組比較，未見(jiàn)明顯異常，術(shù)后第2周可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組腫瘤原發(fā)灶體積增長(zhǎng)明顯快于對(duì)照組，術(shù)后第3周實(shí)驗(yàn)組腫瘤影響兔子進(jìn)食，消瘦明顯。術(shù)后第3、7天，兩組腫瘤原發(fā)灶體積變化比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；術(shù)后第14天及第21天，實(shí)驗(yàn)組腫瘤原發(fā)灶體積變化均明顯大于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表1）。

表1 腫瘤原發(fā)灶切取活檢術(shù)后對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組腫瘤原發(fā)灶體積變化的比較（mm 3，±s）

表1 腫瘤原發(fā)灶切取活檢術(shù)后對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組腫瘤原發(fā)灶體積變化的比較（mm 3，±s）

組別實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組t值P值2 1.8±8.9 1 9.2±7.7 0.4 4 2 0.7 2 4 1 0 2.4±1 1.6 8 8.7±1 1.3 1.1 7 0 0.1 3 2 1 6 3.2±1 2.5 1 2 1.0±1 1.2 5.2 6 0 0.0 0 1 2 0 4.0±1 7.3 1 5 2.0±1 0.3 5.3 4 9 0.0 0 1第3天（n實(shí)=4，n對(duì)=4）第7天（n實(shí)=4，n對(duì)=4）第1 4天（n實(shí)=5，n對(duì)=4）第2 1天（n實(shí)=6，n對(duì)=6）

2.3 HE染色觀(guān)察

對(duì)取下的頜下淋巴結(jié)進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀(guān)察腫瘤轉(zhuǎn)移情況，可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組（共46個(gè)淋巴結(jié)）有7個(gè)淋巴結(jié)能見(jiàn)到腫瘤轉(zhuǎn)移，而對(duì)照組（共44個(gè)淋巴結(jié)）有2個(gè)淋巴結(jié)能見(jiàn)到腫瘤轉(zhuǎn)移，經(jīng)Fisher確切概率法比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.182）。

2.4 免疫組化染色觀(guān)察

對(duì)原發(fā)灶進(jìn)行免疫組化染色觀(guān)察，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組NF-κB、MMP-9、VEGF的陽(yáng)性表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表 2）

表2 兩組舌部腫瘤NF-κB、MMP-9、VEGF表達(dá)水平的比較（±s）

表2 兩組舌部腫瘤NF-κB、MMP-9、VEGF表達(dá)水平的比較（±s）

組別實(shí)驗(yàn)組（n=23）對(duì)照組（n=22）t值P值NF-κB 4.2±1.1 1.9±0.9 7.657 0.000 MMP-9 4.4±1.3 1.8±1.0 7.495 0.000 VEGF 3.4±0.9 1.9±1.2 4.758 0.000

3 討論

病變組織切取活檢被認(rèn)為是腫瘤診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。在臨床工作中，往往需要對(duì)異常組織進(jìn)行術(shù)前病理活檢來(lái)確定是否進(jìn)行手術(shù)治療以及手術(shù)切除的范圍。但有研究顯示，切取活檢會(huì)加速腫瘤的發(fā)展及轉(zhuǎn)移[4]；也有研究認(rèn)為切取活檢短期內(nèi)對(duì)病變部位無(wú)不良影響[5]。切取活檢對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移有何影響，其具體的分子機(jī)制仍不清楚。

本實(shí)驗(yàn)采取改良腫瘤細(xì)胞懸液注入法構(gòu)建大白兔舌癌動(dòng)物模型[6-7]，實(shí)驗(yàn)中成瘤率達(dá)93.75%。與化學(xué)誘導(dǎo)法相比，本方法成瘤時(shí)間短，在第2周即可見(jiàn)到注入部位有瘤體形成；注入部位及注入的腫瘤細(xì)胞數(shù)目可控，使形成的腫瘤組織的部位、所需時(shí)間、腫瘤大小較接近，有利于后期的實(shí)驗(yàn)研究。

本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組腫瘤生長(zhǎng)速度明顯快于對(duì)照組，表明切取活檢會(huì)加速腫瘤原發(fā)灶的生長(zhǎng)。盡管實(shí)驗(yàn)組的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)高于對(duì)照組，但兩組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但劉濟(jì)遠(yuǎn)等[8]認(rèn)為切取活檢會(huì)加速腫瘤原發(fā)灶的增長(zhǎng)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不完全一致，這可能是由于實(shí)驗(yàn)選取的動(dòng)物不一致，所觀(guān)察的腫瘤不同所導(dǎo)致的。

NF-κB是機(jī)體中一個(gè)重要的炎性信號(hào)因子，在腫瘤中也伴有多條炎癥信號(hào)通路的激活[9]。VEGF參與了血管的生成過(guò)程，與腫瘤中微循環(huán)的形成有關(guān)并能促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[10]。MMP能降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白成分，破壞細(xì)胞間的連接，促進(jìn)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組舌部腫瘤中的NF-κB、VEGF、MMP-9的陽(yáng)性表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，提示切取活檢可能通過(guò)促進(jìn)NF-κB、VEGF、MMP-9的表達(dá)來(lái)促進(jìn)腫瘤增長(zhǎng)。據(jù)此推測(cè)切取活檢部位可能會(huì)出現(xiàn)炎性反應(yīng)，使NF-κB的表達(dá)升高，從而上調(diào)VEGF的表達(dá)促進(jìn)腫瘤內(nèi)血管的形成，使腫瘤的增長(zhǎng)加快；同時(shí)使MMP-9的表達(dá)升高，破壞了細(xì)胞間的連接，使腫瘤細(xì)胞能浸潤(rùn)到周?chē)＝M織內(nèi)，使腫瘤面積增大。有研究顯示，切取活檢的結(jié)果使患者的心理壓力增加，長(zhǎng)期的心理焦慮會(huì)影響體內(nèi)的多種激素分泌[12]，干擾了機(jī)體的免疫防御機(jī)制，從而促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，切取活檢能夠促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，但在臨床工作中常先進(jìn)行活檢再擇期手術(shù)。因此，尋找一種能替代病理活檢的新診斷方式或減輕切取活檢對(duì)腫瘤的影響將是以后的研究方向。